Способ получения активированных носителей Советский патент 1981 года по МПК C07G7/02 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВИРОВАННЫХ НОСИТЕЛЕЙ Изобретение относится к химическо и микробиологической промьдшленности и может быть использовано для получе ния активированньос носителей для им мобилизации фвЕментов. Получаемые материалы могут быть применены как химические реактивы и промышленные катализаторы для проведения ферментативных реакций в химической, фарм цевтической и пищевых отраслях промы ленноети. Иммобилизация ферментов путем их присоединения к нерастворимым носителям является хорошо известным спо собом улучшения технологических показателей этих биокатализаторов. Из большого числа носителей заслуживают внимания органоминеральные материалы, в частности покрытые полимерами пористые кремнеземные мате риалы. Носители такого типа характеризуются хорошими гидродинамическими свойствами и достаточной стабильностью получае «их препаратов. Свойства получаемых препаратов во многом зависят от метода внесения и активации полимерного слоя на носителе. Известны способы получения модифицированных твердых носителей путе покрытия поверхности носителя полимером. Например, в качестве лолимера используют полиакролеин. Слой полимера образуется на поверхности носителя в результате пропитывания носителя мономером, содержащим свободные альдегидные группировки.. Полимеризация происходит на поверхности носителя. Иммобилизация фермента производится по реакции между альдегидными группами носителя и аминогруппами фермента 1. Этот способ позволяет получать иммобилизованные на органоминергшьных носителях ферменты. Однако он ограничивает модификацию носителя только альдегидсодержащими полимерами. Связывание ферментов через альдегиды не всегда позволяет получить активные препараты. Кроме того, получаемые линейные полимеры обладают значительной растворимостью и не скрепляют неорганическую структуру носителя. Известен также способ получения водонерастворимого гидрофильного носителя со свободными карбонильными (преимущественно альдегидными) группировками в результате полимеризации акролеина или сополимеризации акролеи на и стирола в присутствии 1,6-гекса метилендиамииа. Иммобилизацию фермен та производят также с помощью реакции между альдегидными группами носителя и аминогруппами фермента 2. Данный способ ограничивает модификацию носителя только альдегидсодержащими полимерами. Связывание фер ментов через альдегиды не всегда (позволяет получить препараты с удовлетворительной стабильностью. Иммобилизованные ферментные препараты, полученные данным способом, обладают очень низкой стабильностью при хране нии и только использование дополнительных приемов способствует некоторому повышению стабильности препаратов . Известен также способ получения воднонерастворимого ферментного препарата путем микрокапсулирования фермента в слой полимера, причем фер («1ент предварительно адсорбируют или ковалентно связывают на поверхности неорганического носителя. Полимер об разуется из полиамина (например, гексаметилендиамина или этилендиамина) и полиизоцианата при 3 Способ иммобилизации ферментов; покрытием уже связанного фермента полимерной микрокапсулой создает дополнительнЪе диффузионное сопротивле ние для субстрата. Катализаторы, полученные путем микрокапсулирования фермента в слой полимера, могут оказаться трудно применимьами при проведении гидролиза макромолёкулярных субстратов, в частности, таких, размер молекул которых превышает или равен размерам молекул иммобилизо-. ванного фермента. Предложены для иммобилизации ферментов стеклянные шарики, покрыты пол14мерным слоем. В качестве полимера используют гидролизованный найлон или сополимер этилена и ангидрида малеиновой кислоты. Полимерный слой пропитывайт раствором фермента и поперечно сшивают глутаровым альдегидом 4 . . Описанный способ дает материалы хорошими гидродинамическими показателями, но сравнительно небольшой удельной поверхностью. Крометого, этот способ, по которому сшивание полимерного слоя сочетается с иммобилизацией фермента, не позволяет провести реакцию в условиях (например, при повышенных температурах), необходимых для получения стойких п лимерных носителей,так как при этих температурах часто протекает инакти вация фермента. Известен также способ получения активированного носителя путем проп ки пористого неорганического матери ала органическим пленкообразующим веществом. В качестве полимера испо уют полиакролеин. Носитель (фарфор, змельченное стекло) пропитывают моомером, содержащим свободные альегидные группировки. Полимеризация роисходит на поверхности носителя. результате модификации таким спообом получёцот носитель со своодными альдегидными группами. Иммоилизация фермента (трипсина, папаина) роизводится путем.взаимодействия льдегидных групп носителя с аминогуппами фермента 5. Недостатком данного способа является малая операционная стабильность получаемых активированных носителей. Покрытие неорганического материала линейными полимерами, образующимися при полимеризации винильных полимеров, не обеспечивает достаточную нерастворимость, а следовательно, стабильность получаемых ферментных |Препаратов. Этот способ также ограничивает модификацию носителя альдегид содержащими полимерами, а связывание ферментов только через альдегидные группы не всегда дает возможность получать препараты с высокой активностью и хорошей стабильностью. Известный способ не обеспечивает также высокого содержания белка на единицу носителя. При иммобилизации трипсина достигается связывание О,2 мг белка на 1 мл носителя. Цель изобретения - повышение операционной стабильности носителей для иммобилизации биоактивных веществ. Указанная цель достигается тем, что в способе получения активированных носителей с повышенной операционной стабильностью путем покрытия пористого неорганического носителя с диаметром поР 200-2000 А органичесKIJM пленкообразующим веществом, содержащим реакционноспособные группы, в качестве пленкообразующего вещества используют эпоксидную смолу и проводят ее отверлдаение на носителе полиэтиленполиамином в соотношении эквивалентов эпоксидной смолы и амина 1:2 при 100-120с в течение не менее 1 ч, после чего материал обрабатывают реагентом, выбранным из группы, включгиощей глутаровый альдегид, диизоцианат адипиновой кислоты, п-бензохинон и бромциан. Способ осуществляется следующим образом. Пористые неорганические носители с диаметром пор 200-2000 & (силохром или силикагель) смачивают 1,7%ным раствором эпоксидной смолы в ацетоне (9 объемов раствора на 5 вес.ч. неорганического носителя). Ацетон выпаривают и проводят затвердение посредством кипячения носителя в 2%ном водном растворе полиэтиленполиамина (соотношение эквивалентов эпоксидной смолы и г1мина 1:2) в течение 1 ч. Носитель отфильтровывают, промывёцот водой, ацетоном и сушат в термостате при 100°С. В резуль тате получают носитель, содержащий на поверхности активные аминогруппы в количестве 150-200 мкэкв на 1 г носителя. Носитель можно использовать непосредственно для иммобилизации белков за счет взаимодействия с аминогруппами, а также можно дополнительно активировать, создавая |На полимерной пленке реакционноспосЬЬные группы различной прирйды. Подходящими активаторами в данном случае являются глутаровый альдегид диизоцианат адипиновой кислоты,пбензохинон и бромистый циан. Активацию указанными реагентами проводят описанными в литературе методами. Пример. Получение носителя модифицированного эпоксидной смолой Для получения носителя проводят пропитывание кремнеземного материгша раствором эпоксидной смолы и затвердение водным раствором полиэтиленполиамина в количестве свыше зквимолярного (соотношение эквивален тов 1:2). 5 г силохрома или силикагеля смачивают 9,0 мл раствора 1,7% эпоксидной смолы в ацетоне. После выпаривания растворителя проводят затверден 15 мл 2%-ного водного раствора полиэтиленамина кипячением При 100°С в течение 1 ч.- Затем носитель фильтруют, пpo ивaют водой и ацетоном и высушивают в термостате при 100°С. В результате получают носитель, содержащий на поверхности активные аминогруппы в количестве 150 мкэкв на 1 г носители. Полученный носитель используют для иммобилизации протеолитических ферментов (трипсина, химотрипсина, панкреатина) с помощью бифункциональных реагентов глутарово го альдегида и диизоцианата адипино вой кислоты, п -бензохинона и бромциана. Пример 2. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, модифицирован ного эпоксидной смолой, активированием глутаровым альдегидом. К 5 г модифицированного эпоксидной смолой носителя (пример 1) добав ляют 15 мл 2%-ного водного раствора глутарового альдегида. Смесь переме шивают и выдерживгиот при комнатной температуре в течение 2 ч. После это го материал омывается дистиллированной водой от непрореагировавшего; ,, глутарового альдегида на воронке Бюхнера до исчезновения глутарового альдегида в промывной воде, и к влажному активированному носителю добавляют 5 мл раствора химотрипсина с концентрацией 50 мг/мл в борат ном буфере рН 8,0. Смесь перемешива ют, вакуумируют для удаления воздуха из пор и вьщерживают при 20 С в еченце 1 ч. После инкубации препаат промывают в воронке Бюхнера боатным буфером рН 8,0, 1М раствором хлористого натрия и затем еще боратным буфером, добавляя эти растворы порциями. Объем промывных вод сотавляет 100 мл. Полученный иммобиизованный препарат хранят во блажом виде в боратном буфере в холоильнике. Ферментативную активность препарата определяют на синтетическом субстрате - этиловом -эфире ацетилтирозина (АТЭЭ). Активность равна 550 Е/г. Стабильность препарата-оценивают по остаточной активности после проведения промывки препарата 100 мл 2%-ного раствора казеина рН 8,0 в колонке с диаметром 6 мм и высотой столба препарата 70 мм в течение 24 ч. После такой помывки сохраняется 70% от исходной активности. П р и м е р 3. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, модифицированного эпоксидной смолой, активированием диизоцианатом адипиновой кислоты. К 5 г модифицированного эпоксидной смолой носителя (пример 1) добавляют 20 мл 0,25 н раствора диизоцианата адипиновой кислоты в толуоле и смесь кипятят при 110°С в течение 1 ч. После этого носитель фильтруют, промывают ацетоном и высушивают при 110°С. Вследствие такой обработки получают носитель с активными изоцианатными группами. Такой носитель смачивает 8 мл боратного буфера. Иммобилизацию проводят как описано в примере 2. Получают препарат химотрипсина с активностью на АТЭ9 1900 Е/г. После промывки препарата 2%-ным раствором казеина сохраняется 41% исходной активности. При иммобилизации панкреатина получают препарат с активностью 1100 Б/г(на АТЭЭ), после промывки казеином сохраняется 32% от исходной активности. П р и м е р 4. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, модифицированного эпоксидной смолой, активированием п-бензохиноном. 5 г модифицированногоэпоксидной смолой носителя (пример 1) нагревают с 20 мл 0,5%-ного водного раствора п-бензохинона на водяной бане в течение 1 ч. Затем носитель промывают водой и ацетоном и высушивают при комнатной температуре. Активированный таким путем носитель смачивают 8 мл боратного буфера. Иммобилизацию химотрипсина проводят как описано в примере 2. Получают препарат с активностью на АТЭЭ 6800 Е/г. После промьшки препарата 2%-ным раствором казеина остаточная активность составляет 57% от исходной.

Примерз. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, модифицированного эпоксидной смолой, активированием бромцианом.

5 г модифицированного эпоксидной смолой носителя (пример 1) нагревают с 20 мл 1,1%-ного водного раствора бромциана на водяной бане в течение 1 ч. Затем носитель промывают водой и высушивают при комнатной температуре. Получают носитель с активными циан-группами. Активированный таким путем носитель смачивают 8 мл боратного буфера. Иммобилизацию химотрипсина проводят как описано в примере Получают препарат с активностью 33,6 Е/г (активность определяют на 2%-ном казеине). После промывки препарата 2%-ным раствором казеина остаточная активность составляет 16% от исходной.

Предлагаемый способ позволяет получать носители, в которых внутрення поверхность пор покрыта слоем действительно нерастворимого полимера, содержащего любые реакционноспособные группы, необходимые для иммобилизации ферментов. Образование в порах носителя полимерной пленки закрепляет структуру носителя, уменьшает нежелательное адсорбционное взаимодействие фермента с иосителем и предотвращает вымывание фермента с носителя из-за растворимости кремнезема при рН 7 и выше. Способ позволяет получать препараты иммобилизованных ферментов с повышенной стабильностью и повышенной удельной активностью на грамм носителя.

Формула изобретения

Способ получения активированных носителей путем пропитки пористого неорганического материала органическим пленкообразующим веществом, содержсШ(им реакционноспособные группы, отличающийся тем, что, с целью повышения операционной стабильности получаемых материалов, в качестве пленкообразующего вещества используют эпоксидную смолу, проводят ее отверждение на носителе полиэтиле нполиамином в соотношении эквивалентов эпоксидной смолы и амина 1;2 при 100-120°С в течение не менее Д ч, после чего материал обрабатывают реагентом выбранным из группы, включающей глутаровый альдегид, диизоцианат адипиновой кислоты,п -бензохинон и бромциан.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент ФРГ № 2229298, кл. С 07 G 7/02, опублик. 1972.

2. Патент ФРГ № 2104810,

С 07 G 7/02, опублик. 1971.

кл.

3.Патент Великобритании № 1396714, 0 кл. С 07 G 7/02, опублик. 1975.

4.С. Horvath. Pellicular inmobilized enzymes Bioch. Biopti. Acta. 1974, 358, 164-177.

5.Патент Великобритании № 1342186, 5 кл. С 07 Н 1/02, опублик. 1973 (прототип) .