Способ получения гетерополисахарида Советский патент 1988 года по МПК C12P19/06 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/64 

со

00

о

О5

00 со

Изобретение относится (тех- нологии и касается способа получения ксантанового гетерополисахарида, который может быть использован в качестве эффективного агента в пищевых продуктах, косметике и т.д. Целью изобретения является повышение выхода и улучшение физико-химических свойств полисахарида. Способ заключается в выращивании нового штамма Xanthomenas campestris NCIB 11854, который обладает высокой скоростью роста и биосинтетической активностью и способен накапливать порядка 14 г/л полисахарида. 6 табл.

(/4

1П

Изобретение относятся к биотехнологии и касается способа получения ксантанового гетерополисахарида, который может быть использован в качестве эфсЬективного агента в операциях по вторичной регенерации масел, загустителей в пищевых продуктах, кос метике н т.д. и также в качестве агентов, способных образовывать съе добную пленку, и в качестве эмульгирующего агента, например, в чернилах для печатания, а также в качестве загустителя в пастах для печатани в текстильной промьшшенности,

Целью изобретения является увеличение выхода и улучшение физико-химических свойств полисахарида, , Новый штамм; Xanthomonas campestri депонирован в Национальной Коллекции Лромьппленных Бактерий, Торри Рисеч Стейшн, Абердин под номером 11854, Штамм NCIB 11854 демонстрирует более высокую скорость роста в синтетической солевой среде, значительно более высокую специфическую скорость производства полимера и его можно вьфа- Щ-ивать как в непрерывных условиях, так и периодических.

Национальная Коллекция Промышлен- ных- бактерий располагает также штаммом NCIB 11виз, который обладает сходными признаками со штаммом NCIB 11854,

Морфолого-культуральные и физио- лого-биохимические призЧ1аки штамма,

Морфолого-культуральные признаки, А Окислительный питательный бульон СМ1 + 0,75% агара Дифко инокулировал молодыми выросшими микроорганизмами и инкубировали в течение 7,5 ч при , Клетки с пятен размером вырос - шей культуры 0,2 мм исследовали и фотографировали на месте (in situ) при фазовом контрасте со скользящей диафрагмой. Подвижность и другие характеристики определили в пулах, окружающих и, 1 jU M стеклянные шарики, расположенные на других пятнах. Клетки на краях выросшей культуры встречались по одной и парами, при этом размер клеток составляет: ширина 054-055jU м и длина 1,2-2,5 IUM для NCIB 11803 ширина 0,5-0,6 рм и длина 1,2-2,5 рм для NCIB 11854. На полях выросших культур в пулах видны агрегаты, сос тояпще по количеству от сотен до не- сколькргх тысяч клеток с NCIB 11803, но намного NCIB 11854. Мобиль

д 5

0 5

о

„

5

5

0

5

32

кость положительная. При использовании условий, как в А, но с добавлением 0,5% глюкозы в среду и инкубированием в течение 7 ч, получили аналогичные результаты, за исключением того, что клетки были на О,1р м шире и не бьши видны агрегаты с NCIB 11854,

Б, После выращивания в течение 48 ч при 30°С в чашках с окислительным питательным агаром СМЗ наблюдали хороший -рост, выделенные колонии желтого цвета, круглые, целые, слизистые, гладкие, волокнистые и выпуклые. Диаметр колоний для 11803 1-1,5 мм для NCIB 11854 1,5 мм,

В. Спустя 72 ч после начала выращивания при 30°С на среде, аналогичной в А, но с добавлением 1% глюкозы, рост был хорошим, выделенные колонии бледно-кремового цвета, круглые, целые, очень слизистые, гладкие и выпуклые, в то время как выросшие слившиеся колонии желто-кремового цвета. Диаметр колоний для NCIB 11803 2 мм и для 11854 2,2,5 мм.

Селективная морфология. Минеральное основание Паллерони 6 Доудорофф 1972 модифицированное (PD), г: Na7HP04 12Н,06,0

КН Р042,4

NH4C1 .1,0

MgS04-7H200,5

РеС1з-бН О . 0,01 CaCli-бН О0,01

Деионизированная водаДо 1 л

рН 6,8

PD минеральное основание + 0,1% фильтро-стерилизованная глюкоза (PDG), желатиновый столбик, %:

Питательный бульон

№ 2 (Оксоид)2,5

Желатина (Дифко) 12,0

Желатиновые чашки.%: Питател ьный агаровый ОКСОИД СМЗ2,8

Желатина1,0

Молочные чашки, %: Снятое молоко (Дифкo), отдельно стерилизованное3,0

Пептон (Дифко)О,1

Экстракт ветчины LabLeracoО,1

NaCl0,5

Агар1,5

рН 7,4 до автоклавирования

Биохимические характеристики: при за исключением особо оговоренных случаев, рост при на СМЗ чашках:

Температура,°С 5337

Рост (не количественньй) + + Интервал роста

рН на СМ1 бульоне (выверенный

рН)

рН3 5 7,2 8 9 10

Рост -3+3+ 3+ 3+ 3+

Рост в присутствии соли. Основная среда, содержащая NaCl в концентраци 2,3,4 и 5%, приготовлена в соответствии со способом по Хейварду и Ходжки су. Культуры инкубировали в течение 3 дней.

NCIB 11854 менее терпим к соли, чем NCIB 11803.

NaCl, % 2345

NCIB 11803 рост 3+ 3+3+

NCIB 11854 рост 3+3+ + -

Гидролиз желатины и казеина.

Культуры инкубировали в течение 7 дней. Желатиновые столбики содержались при 20°С. NCIB 11854 показал меньшую степень протеолитической активности, чем NCIB 11803 (см. табл.1

Тесты на требования факторов рост Субкультуры подготовили в виде прямой проволоки трижды в среде PDG с дистиллированной водой на стекле. Получили удовлетворительньй рост через 4 дня, при этом особых требований к факторам роста не бьто.

Тест на стимулирование метионимом Одну каплю слегка мутной молодой выросшей культуры в среде PDG с дистиллированной водой на стекле инокулиро вали в PDG с и без IOjUr/мл L-метио- нином в 1 мл -в 16 мм трубках. Факта стимуляции скорости роста L-метиони- ном не наблюдали.

Использование источника углерода.

Среду PD с одними источниками углерода (0,1%), стерилизованными с фильтром (табл. 2), инокулировали и инкубировали в течение 14 дней. Обнаружили слабые расхождения в скоростях роста между штаммами.

Получение кислоты из углеводов.

К окислительно-ферментационной среде Хейварда и Ходжкиса добавили 1 стерилизованных с -фильтром источников углерода, приведенных в табл. 2 (знак + - вместо UL). Трубки инокули

0

5

0

5

5

0

5

0

5

0

ровали и инкубировали в течение 14 дней. Кислоту получали из галакто- ,зы и мелибиозы с помощью NCIB 11854, но не NCIB 11803.

Грамотрр цательные неферментативные вещества даны в табл. 3.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что штамм 11854 демонстрирует лучшую кинетику производства полимера в определенной среде, лучший- рост с неорганическим азотом (в особенности ) и стабильность в непрерывной культуре в синтетической солевой среде.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример. Xanthomonas campestris NCIB 11854 выращивают.на трех различных химических синтетических соЛевых средах (табл. 4) в сосуде емкостью 7 л, в циклических условиях.

В первом эксперименте единственным источником азота для роста микроорганизмов служит ион аммония (24 мМ), позволяющий достичь экспонентного роста клеток до максимальной концентрации 3 г/л.

Во втором и третьем экспериментах аммоний заменяют нитратом (24 мМ) и глютаматом (24 мМ) соответственно.

Результаты приведены на фиг. 1-3.

Как видно из сравнения схем по фиг. 1-3, глютамат как источник азота является наиболее предпочтительным, поскольку он дает ( макс, т.е. максимальную скорость роста клеток 0,12 , qnвeличинy, т.е. специфическую скорость производства полиме- ра в 0,36 г () ч и конечный выход полимера В 0,59 . Эта комбинация высокой |L макс и высокой qn дает продуктивность полимера в итоге 0,49 г ( , что вдвое больше обычной продуктивности гетерополисахаркдной ферментации с использованием Xanthomonas campestris NRRLB-1459.

На табл. 5 (А) приводится |ц макс, qn, гг , т.е. специфическая скорость расхода глюкозы, В„ - выход полимера на глюкозе и П - полимерньм продукт для Xanthomonas campestris NCIB 11854, в определенной вьщге ростовой среде с солями и (В) - соответствующие величины для Xanthoraonas campestris NRKL В-1459.

Условия роста для культуры Xantho- monas campestris NCIB 11854 следующие:

Температура,С

РН

Импеллер

Скорость импеллера, об/мин Объем культуры, л

13 28

6,8

Турбина Раштона с лопастями 3 4

1000

4,5-5,0 1N NaOH+1N КОН

780 мм Hg

рН контроль

Давление растворенного Oj

Скорость потока

воздуха, л/мин 1,0

Как видно из табл. 5, улучшилось действие Xanthomonas campestris NCIB 11854 в сравнении с Xanthomonas campestris NRRL В-1459.

В табл. 6 даны сравнительные данные фильтрационной способности Xanth monas campestris 11854 бульона с фильтрационной способностью Xanthomonas campestris NRRL В-1459 бульона при разбавлении до постоянной вязкости в растворах различной солевой концентрации. Фильтруемость растворо с вязкостью 20 сПз (вязкость измерен при коэффициенте сдвига 7,5 с ). Для фильтрации используют фильтры Миллипор (торговая марка), имеющие диаметр 47 мм 5|ии 1,2(u- размеры пор. Как видно из табл. 6, фильтруе- мость бульона с Xanthqmonas campestris NCIB 11854 до и после знзимати

ческой обработки значительно лучше, чем у известного.

Формула изобретения

Способ получения гетерополисахарида, предусматривающий выращивание микроорганизма-продуцента вида Xanthomonas campestris на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу, источники азота, фосфо- ра, минеральные соли и воду, в условиях аэрации и перемешивания др максимального накопления целевого продукта и последующее его выделение, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода и улучшения физико-химических свойств гетеро

0

5

0

5

0

5

о 5

полисахарида, в качестве микроорганизма-продуцента используют штамй Xanthomonas campestris NCIB 11854, при этом в питательную среду в качестве источника азота вводят глютамат натрия, минеральных солей - хлористый кальций двуводный, серно-кислые магний, железо (II), марганец, цинк се- миводные, серно-кислую медь пятивод- ную, хлористьм кобальт шестиводный, молибдёновокислый натрий двуводньш, йодистый калий и борную кислоту при следующем соотношении входящих в нее ингредиентов, г/л воды:

Глюкоза23,4

Глютамат натрия 24,0 Фосфорно-кислый калий однозамещенный 25,0 Фосфорно-кислый натрий двузамещенньй 25,0 Хлористый кальций двуводный1,0

Серно-кислый магний семиводный2,0

Серно кислое железо (II) семиводное 0,2 Серно-кислый марганец семиводный20,0x10

Серно-кислый цинк семиводньй20,Ох to

Серно-кислая медь пятиводная20,0x10

Хлрристьй кобальт шестиводньм 10,0x10 Молибденовокисльй натрий двуводный 10,0x10 Йодистый калий 10x10 Борная кислота 10x10 ВодаДо 1 л

-Э,-3

-3

,-i

-3

До Таблица

1

NCIB 118U3

NCIB 11854

слабый 4

Следы

Слабое

+

+

+

+

Слабое

и-

с

Слабое

Цитраконат

13896838

Таблица2

Слабый Слабый

+ +

Слабый Слабый

Слабый

138968310

Продолжение табл. 2

.

- - -

- - - - -

- - Слабое + - . Слабый

+ + - Слабый

- .

тич еские и другие циклические соединения

-

t

-

ею

- -

-

- II

Триптамин- . амиламин Различные соединения

Бетаин

Пантотенат Углеводы и производные сахара (продолжение)

Добавочное соединение,

Показатели

11803 J И854 I 11803 1 11854 Tl1803 Il1854

и нкубации, °С 30

я

30 30 Глюкоза

Коричневый диффундирующий

ONPG

Пигмент в куль- туральном булБ- оне Apr. Mller

-

Лиз. Mller Орн. Mller NOj до NOj

13а9б8312

Продолжение табл. 2

ТаблицаЗ

Вьщеленный NCIB

30

30 30 Рост при,°С

30

s- c

- з -с

-37°С -Рост при рН 3-5 3+

13

ность G

н

В

к факто

N0- до N, Остат. N0,

ДНК-аза

+++

+++ +++ ь

+++ +++

++

(Глюко- (Глйко- за CSU) за. CSU)

Пепто- Пенто- низи- низи- рова- рова- но но Вьщелб- Вьщеле- но но

1389683

14 Продолжение табл. 3

7,2 3+

- 8

+9

10

+7 лб.

+

+ + - +

3+ 3+

3+ -7

+ Слаб.

+

3+

3+ 3+

3+

Рост в NaCl

27, 3+ 3+ 3% 3+ 3+ 4% 3+ 3+

5% - ная слаб. слаб.

+

- Коричневый - дифс1)ундирую- щий пигмент

В трипроновом бульоне

Apr Торнли

0

24,5 (г/л)24,3 (Г /л)

12 (24 мМ N)

24

25 25

2

1

0.2

20x10 20x10 20х10 10x10 10x1U 10x10 10x10-

25 25

2

1

0,2

20x10 20x10 20x10 10x10 10x10 10x10 10x10

НО - не определено

Таблица4

23,4 (г/л)

24 25 25

2

1

0,2

20x10- 20x10 20x10 10x10 10x10-3 10x10 10x10

Таблица5

А. В 1% NaCl + 0,1% CaClj при 30 С и избыточном давлении 1 атм

энзшлом в. в 1% NaCl + 0,1% CaCl, при 70°С под давлением 1 атм

NC1B

Бульон

7,5

Таблицаб

37,3

Пф - префильтр для сепарации грубого материала

Без предварительного фильтра, но раствор ранее пропускали через 5|U префильтр.

Продолжение табл.6

в «

А

SO SfleMffr)

го

фиаЗ

ЪО О5О

frj