Способ определения кислых гликозидаз в ткани печени Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

10

20

Изобретение относится к биохимии, частности к исследованиям в энзи- .

Целью изобретения является повыение точности и сокращения времени нализа за счет использования в каестве химического реагента раствоа дезоксихолата в 0,5 М гидроокиси атрия..,.,

В опытах испольвуют интактных самов кроликов породы Шиншилла масой 2,5-3,5 кг. Печень перфузируют на льду ледяным физраствором, промокают бумажными фильтрами, тщательно очищают от соединительной ткани и взвешивают. Гомогенат готовят из расчета 1:9 (вес ткани на объем среы для гомогенизирования).-Гомогенизацию проводят в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейема с тефло- новым пестиком (зазор 0,21 мм) 30 с при 1200 об/мин. В качестве источника фермента используют обогащенную фракцию лизосом, полученную дифференциальным центрифугированием с исполь- 25 зованием градиента сахарозы.

Затем проводят определение кислых 1 ликозидаз . В пробы добавляют 0,5 мп буфера, 0,5 мл 15 мМ раствора субстрата, 0,5 мл ферментного препарата . Использутот 0,2 М цитратный буфер, величина которого равна 4,0j 4,5 и 5,5 для определения -галактози - дазы, /i-глюкозидазы и -Н-ацетил- глюкозаминидазы соответственно. Субстратами служат 4-нитрофенильные производные соответствующих сахароз. Инкубацию проб осуществляют при 37°С в течение 30 мин. Затем добавляют 2 мл О,135%-ного раствора дезоксихолата в 0,5 М NaOH. Холостые опыты ставят, инкубируя только субстрат и буфер. Фермент вводят непосредственно после добавления останавливающего реакцию реактива. Оптическую плотность исследуемьк растворов измеряют на спектрофотометре СФ-26 при 405 нм относительно контрольной пробы. Абсолютный выход свободного агликона определяют, сравнивая из- 50 меренные в опыте величины экстинкции с калибровочной кривой. Для построения калибровочной зависимости к стандартным растворам агликона добавляют соответствующее методике коли- 5 чество реактива, останавливающего реакцик). За единицу активности принимают 1 катал. Удельную активность ферментов выражают числом

35

40

45

30

талов, отнесенному к 1 мг белка. Белок определяют методом Лоури.П р и М е р 1. В опыте используют кроликов-самцов породы Шиншилла массой 3 кг. Гомогенизацию печени проводят в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейема с тефлоновым пестиком 30 с при 1200 об/мин. В качестве источника фермента используют обогащенную фракцию лизосом, полученную дифференциальным центрифугированием.

Определяют активность кислых гли- козидаз. В пробу добавляют 0,5 мл

буфера, 0,5 мл 15 мМраствора.субстрата и 0,5 мл ферментного препарата. Используют 0,2 М цитратный буфер, величина рН которого была равна 4,0; 4,5 и 5,5 для определения -галак- тозидазы, /з гликозидазы и -N-ацетил- глюкозаминидазы соответственно. Субстратами служат 4-нитрофенильные производные соответствующих Сахаров. Пробы инкубируют при ЗУс 30 мин, добавляют 2 мп раствора дезоксихолата в О, 5 М NaOH в концентрации 0,01 мг/мл при концентрации белка в пробе 1 мг/мл. Холостые опыты ставят, инкубируя только субстрат и буфер. Фермент вводят в контрольную пробу непосредственно после Добавления .останавливающего реакцию реактива. Оптическую плотность исследуемых растворов измеряют на спектрофотометре СФ-26 при длине волны- 405 мм относительно контрольной пробы. За единицу активности принимают 1 катал. Удельную активность ферментов выражают числом нкаталов, отнесенному к

1 мг белка. Белок определяют методом Лоури.

При этом выявлено, что опалесцен- ция. в пробах не устраняется и спек- трофотометрия таких растворов невозможна.

Пример 2. Определение активности ферментов проводили как в примере 1, но при концентрации раствора дезоксихолата 0,02 мг/мл.

При этом получили прозрачные растворы. Активность /5-галактозидазы, д- -глюкозидазы и /1-Ы-ацетилглюкозамин идазы равна 5911,2; 13912, 4 и 119t2, 9 соответственно.

Пример 3. Определение активности ферментов проводили как в примере 1, но при концентрации раствора дезоксихолата 1,0 мг/мл«

При этом-получили активность/5- галактозидазы, /j-глюкозидазы и w-N- -ацетилглюкозаминидазы, равную 58tO,9; 137±1,7 и 12113,1 соответственно.

Пример 4. Определение активности кислых гликозидаз проводили как в примере 1, но при концентрации раствора дезоксихолата 200 мг/мл При этом активность /ь-галактози- дазы,-глюкозидазы и -N-ацетилглю- козаминидазы была равна 57±2,1; 136-3,2 и 117i3,3 соответственно. Апробацию метода осуществляли, определяя активность гликозидаз и.з печени интактныхживотных;Результаты этой серии опытов суммированы в табл. 1 . Значения случайных погрешностей предлагаемого способа оценивали, рассчитывая основные метрологические харак- теристики т, d, S, Е, и Sf, являющиеся мерой воспроизводимости, из результатов десяти параллельных определений. Значения удельной активности для всех исследованнык; фермен- тов, определенные первым методом (1) был выше, чем вторым (II), Надежность, точность и воспроизводимость результатов анализа предлагаемым способом выше и лучше в 1,5-2,5 раза (особенно для /i -N-ацетилглюко- заминидазы), чем при использовании ТХУ. Ошибка метода менее 0,7%, чувствительность равна 0,26 мкМ, Степень рассеивания отдельных измерений око- ло средней низкая, менее 2,5%.

Примеры выполнения способа на граничные значения параметров 400-410 нм

Выборочйое среднее, Х-10-

139

Стандартное отклонен среднего результата,цп -10

Абсолютная воспроизводимостьСреднее отклонение от среднего, d -10

с приведением конкретных данных, подтверждающих достижение цели при этих значениях, приведены в табл. 2. Из табл. 2 видно, что в указанном диапазоне длин волн от 400 до 410 нм точность измерения максимальна: от 97 до 100%. Увеличение или уменьшение длины волны приводило к резкому снижению точности определения. Таким образом, измерения количества аглика- на в пробе, а следовательно, и активности гликозидаз с максимальной точностью возможны только в указанном диапазоне длин волн.

Таким образом, предлагаемый способ определения гликозидаз обладает высокой чувствительностью, точностью и надежностью определения, отличается простотой и быстротой анализа (время анализа сокращается на -40- 50 мин).

Формула изобретения

Способ определения кислых гликозидаз в ткани печени путем гомогенизации пробы инкубации с субстратом с последующим добавлением химического реагента и спектрофотометриро- ванием, отличающийся тем, что, с целью повьшения точности способа и сокращения времени анализа, в качестве химического реагента используют раствор дезоксихолата в 0,5 М гидроокиси натрия в концентрации 0,02-200 мг/мл, а измерение оа- тической плотности проводят при длине волны 400-410 нм.

Таблица 1

59

119 121 40 93

0,15 0,9 0,62 0,28 1,8

0,66 2,16 1,16 0,82 3,84

ТО

2,0

1,1

0,6

0,8

В качестве останавливающего реакцию реактива применяли 0,135%-ный раствор дезоксихолата в 0,5 М NaOH (I) и 3,3% ТХУ (II).

Расчеты статистических показателей проводили на основании результатов десяти параллельных определений активности /5-глюкозидазы (1), ув-галактозидазы (2) и в-Н-апетилглюко 1аминоксидазы..

Таблица2

Зависимость коэффициента инструментальной чувствительности фотометрической реакции и точности определения от длины волны.

Продолжение табл.1

1,56,0 4,0 3,1

10,0

1,22,8 1,7 1,6, 5,7

1,01,8 1,0 2,04,1

2,02,4 1,4 4,06,1

Изобретение относится к биохимии, точнее к исследованиям в энзи- мологии. Цель изобретения - повьпие- ние точности и сокращение времени анализа путем использования в качестве химического реагента раствора дезоксихолата в 0,5 М гидроокиси натрия в концентрации 0,02-200 мг/мл. Для этого печень интактных самцов кроликов перфузируют на льду ледяным физраствором, очищают от соединительной ткани, гомогенизируют. В качестве источника фермента - обогащенная фракция лизосом, полученная дифференциальным центрифугированием с использованием градиента сахарозы. Затем определяют кислые гликозидазы. В пробы добавляют 0,5 мл цитратного буфера, 0,5 мл 15 мМ раствора субстрата, 0,5 мл фермента, рН буфера 4,0; 4,5; 5,5 для определения /j-ra- лактозидазы, /з-глюкозидазы и g-N- -ацетилглюкозаминидазы соответственно. Субстраты - 4-нитрофенильные производные соответствующих Сахаров. Инкубацию проб ведут при 30 мин. Затем добавляют 2 мл 0,135%-ного раствора дезоксихолата в 0,5 М NaOH, При холостых опытах инкубируют .субстрат и буфер. Фермент вводят сразу после добавления реактива, останавливающего реакцию. Оптическую плотность исследуемых растворов измеряют на спектрофотометре СФ-26 при 400- 410 нм относительно контроля. 2 табл. i 1(Л