Способ определения целлюлолитической активности ферментов Советский патент 1979 года по МПК G01N33/14 

I

Изобретение отностся к спиртовой гфомышле1шости, а именно к способу определения активности целлюлолитических ферментов, гидролизующих некрахмалистую часть углеводов зернового сырья при производстве спирта.

Известен способ определения цеплюлолитической активности ферментов путем ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего субстрата, инкубации анализируемой и контрол ной проб, инактивации фермента в анализируемой пробе, фильтрации, введения реактива, колориметрирования и расчета целлюлолитической активности 1.

Недостатком данного способа является то, что используемые субстраты содержат наряду с целлюлозой ряд примесей, в том. числе и гемицеллтолозу, которая гидролизуется целшололитическими ферментами также до углеводов. Следовательно, полученное этим методом содержание углеводов не будет соответствовать истинному, образующемуся в результате гидролиза чистоГ; целлюлозы.

Целью настоящего изобретения является повышение точности и упрощение процесха.

Это достигается тем, что в качестве целлюлозосодержащего субстрата используют оболочки овса, предварительно измельченные и освобожденные от гемицеллюлоз, после ферментативного гидролиза из гвдролизатов осаждают высокомолекулярные углеводы, а в качестве реактива используют антроновый реагент, при зтом после колориметрирования определяют количество сбраживаемых спирторастворимых углеводов, а расчет целлюлолитической активности ведут по формуле:

ЦА,. 0,953-С + 0.0088 п

где ЦА - целлюлолитическая активность, ед/г; С - содержание спирторастворимых углеводов, г; п - содержание ферментного препарата

в реакционной среде, г; 0,953 и 6,0088 - постоянные расчетные ко-, эффициенты.

Способ заключается в следующем. Целлюлознь1й субстрат получают из оболочек овса путем размалывания на вибромельнице до порошкообразного состояния (гфоход через сито с диаметром отверсти 0,25 мм). Полученный порошок подвергают кислотном гидролизу 2%-ным раствором HCI в колбе, снабженной обратным холодильником, в течение 5 ч при непрерывном помешивании и подогреве на магнитной мешалке или водяной бане. Порошок промывают дистиллированной на стекля1шом фильтре до исчезновения кислой реакш1И. Для отделения гемицеллюлозы из полученного пороижа проводят обработ ку его 8 объемами 47о-ного раствора NaOH в течение 2 ч при периодическом помешивании в стакане. Затем содержимое стакана центрифугируют и осадок промывают горячей дистиллированной водой до исчезновения шелочной реакции; порошок высушивают при 37°С и используют в качестве субстрата. В стаканчик размером 2,5 х 6,0 см помешают 100 мл субстрата, приливают 5 мл ферментного раствора И 2 мл ацетатного буфера с рН 4,7. Содержимое стаканчика инкубируют в течение 60 мин при 50°С, затем выдерживают в кипяшей водяной бане в течение Ш мин для ипактивавди, охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумаж ный фильтр. Контрольную пробу готовят аналогично , испытуемой, используя предварительно инактивированный ферментный раствор. В полученных фильтратах ощмделяют спирторастворимые углеводы. Для этого 1 мл фильтрата помешают в мерную колбу емкость 25 мл и приливают до метки этиловый спирт для осаждения высокомолекулярных уг леводов. Содержимое колбы перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр. Затем в пробирки с притертыми пробками наливают по 5 мл антронового реагента и осторожно по стенкам пробирки приливают по 2,5 мл исследуемого и контрольного спиртовых фильтратов. Энергично неремешивают и выдерживают в кипяшей водяной бане в течение 6 мин. Затем содержимое пробирок охлаждают до комнатной температуры и колори метрируют на ФЭК-56М в кювете с длиной грани 5 мм с использованием светофильтров X - 597 нм и X 440 нм. Содержание углеводов рассчитывают по специальному уравнению, выведенному на основании экспериментальных данных зависимости отической плотности от количества глюкозы в стандартных растворах, которое имеет вид: С (14,28 D( - 20,77 Dj) п г/100 мл, где С содержание спирторастворимых углеводов, г/100 мл; оптическая плотность при X 597 им; D2 - оптическая плотность при X 440 нм; 14, 28 и 20,77 - постоянные расчетные коэффициенты;п - коэффициент разведения. Целлюлолитическую активность определяют по расчетному уравнению, выведенному на ос- , новании зависимости количества образовавшихся в результате ферментативной реакции углеводов от количества единиц активности, введенных в реакцию. За единицу активности. принято такое количество фермента, которое в стандартных условиях гидролизует до сбраживаемых углеводов 1 мг целлюлозы, составляюший 0,4% от введенного в ферментативную реакцию количества целлюлозы. Пример вьшолнения способа. Для анализа взят ферментный препарат целлокандин ГЗХ в количестве 100 мг/100 мл дистиллированной воды. Из этого раствора приготовлен рабочий раствор, содержаший 0,35 мг фермента в 1 мл раствора. В стаканчик помещают 100 мг субстрата, полученного из оболочек овса вышеуказанным методом, 5 мл рабочего ферментного раствора и 2 мл ацетатного буфера с рН 4,7. Аналогично готовят контрольную пробу, используя инактивированный рабочий ферментный раствор. Содержимое стаканчиков инкубируют при 50° С в течение 60 мин. Затем исследуемую гфобу выдерживают в термостате в течение 710 мин в кипяшей водяной бане для инактивации фермента. Обе пробы фильтруют через бумажный фильтр. В две мерные колбы емкостью 25 мл приливают по 1 мл фильтратов и доводят до метки 96%-ным этиловым спиртом. Вьшавший осадок высокомолекулярных углеводов отфильтровьшают через бумажный складчатый фильтр и в фильтратах определяют содержание спирторастворимых углеводов. Для этого в пробирки с притертыми пробками наливают по 5 мл антронового реагента и по 2,5 мл спиртовых фильтратов. Содержимое. энергично перемешивают и выдерживают в течение 6 мин в кипяшей водяной бане. Пробы охлаждают и колориметрируют на ФЭК-56М в кюветах с длиной грани 5 мм и со светофильтрами с X 597 нм и X 440 нм. Получили, что DI 0,320, а Dj 0,060. Подставляя получе1шые величины оптических плотностей в расчетное уравнение, получают содержание спирторастворимых углеводов: С (14,2«0,320 - 20,77-0,06) 0,875 2,90 мг, где 0,875 - коэффициент разбавления. 56 Подставляя полученное содержание спирторастворимых углеводов в расчетное уравнение получаем целлюлолитическую активность: 0,953 2,90 + 0,0088 - 163,08 ед/г где 0,0017 - содержание ферментного гфепара.та в реакционной среде, рассчитанное в зависимости от его количества, взятого на анализ на 100 мл воды. Использование предлагаемого способа позволит повысить точность определения целлюлолитической активности фермента.

Формула изобретения

Способ определения целлюлолитической активности ферментов путем ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего субстрата, инкубацщ анализируемой и контрольной проб, инактивации фермента в анализируемой пробе, фильтрации, введения реактива, колориметрирования и расчета целлюлолитической активности, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения

где ЦА - целлюлолитическая активность, ед/г; С - содержание спирторастворимых углеводов, г; п - содержание ферментного препарата

в реакционной среде, г;

0,953 и 0,0088 - постоянные расчетные. коэффи1шенты.

Источники информа у™, принятые во внимание при экспертизе 1- Фениксова Р. В. Методы современной

биохимии, 1975, с. 23-25. 1фоиесса, в качестве целлюлозосодержащето субстрата используют оболочки овса, предварительно измельченные н освобожденные от крахмала и гемицеллюлоз, после ферментативпого гидролиза из гидролизатов осаждают высокомолекулярные углеводы, а в качестве реактива используют антроновый реагент, при этом после колориметрирования определяют количество сбраживаемых спирторастворимых углеводов, а расчет целтололнтической активности ведут по формуле: ЦА 0,953С + 0,