СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ ПИЩЕВЫХ БЕЛКОВ Российский патент 2013 года по МПК C12Q1/34 C12Q1/37 G01N33/02 

Заявляемое изобретение относится к области биохимии и биотехнологии и может быть использовано при биохимических исследованиях для определения количественного содержания не только пищевых белков, но также и пищевых углеводов и жиров в продуктах растительного и животного происхождения.

Известен способ определения количественного содержания пищевых белков, включающий последовательно проводимые смешивание опытных образцов субстрата и ферментативного вещества в соединении со стабилизирующим раствором, инкубирование образованной смеси при температуре 37°С и определение количественного содержания пищевых белков расчетным путем (авторское свидетельство SU №1247750, МПК G01N 33/48).

Поскольку в этом известном способе определение количественного содержания пищевых белков производят по количеству общего остаточного белка в опытном образце субстрата в сравнении с контрольной пробой в виде опытного образца субстрата, который не инкубируют в ферментном растворе, то это приводит к повышенной длительности и многоступенчатости процесса исследования, необходимости применения более сложного технологического оборудования и реактивов и не обеспечивает достаточной точности в определении количественного содержания пищевых белков.

Известен способ определения количественного содержания пищевых белков, включающий последовательно проводимые смешивание опытных образцов субстрата и ферментативного вещества в соединении со стабилизирующим раствором, инкубирование образованной смеси при температуре 37°С, центрифугирование образовавшегося после инкубирования ферментативно-субстратного комплекса для получения чистой жидкой фракции и определение количественного содержания пищевых белков расчетным путем (патент RU №2022021, МПК C12Q 1/00, 1/37).

Данный способ определения количественного содержания пищевых белков, являющийся наиболее близким по совокупности признаков к заявляемому способу, также не позволяет обеспечить необходимую точность определения количественного содержания пищевых белков и требует повышенных затрат времени и многоступенчатости на процесс исследования и более сложного технологического оборудования и дорогих реактивов, поскольку определение количественного содержания пищевых белков производят по количеству содержания общих белков соответственно в опытных и контрольных пробах. Кроме того, данный способ не имеет возможности определения количественного содержания пищевых углеводов и жиров, поскольку в качестве ферментативного препарата используют только протеолитические ферменты (пепсины, папаины), которые не способны определять содержание пищевых жиров и углеводов.

Технический результат заявляемого способа определения количественного содержания пищевых белков заключается в повышении точности определения количественного содержания пищевых белков.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе определения количественного содержания пищевых белков, включающем последовательно проводимые смешивание опытных образцов субстрата и ферментативного вещества в соединении со стабилизирующим раствором, инкубирование образованной смеси при температуре 37°С, центрифугирование образовавшегося после инкубирования ферментативно-субстратного комплекса для получения чистой жидкой фракции и определение количественного содержания пищевых белков расчетным путем, смешивание опытных образцов производят с ферментативным веществом в виде панкреатического сока, предварительно разбавленного стабилизирующим раствором до 50% концентрации при его соотношении с массой опытного образца субстрата 1:10, инкубирование подготовленной смеси ведут в течение 5-15 минут, перед проведением определения количественного содержания пищевых белков расчетным путем полученный в результате центрифугирования объем чистой жидкой фракции разбавляют стабилизирующим раствором в соотношении 1:100-200, при этом количественное содержание пищевых белков определяют как равное процентному расходу ферментов протеазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока.

Кроме того, на стадии определения количественного содержания пищевых белков расчетным путем при необходимости дополнительно проводят определение количественного содержания пищевых углеводов и жиров, при этом содержание пищевых углеводов определяют как равное процентному расходу ферментов амилазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока, а содержание пищевых жиров определяют как равное процентному расходу ферментов липазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока.

Использование в предлагаемом способе определения количественного содержания пищевых белков в качестве ферментативного вещества раствора панкреатического сока, представляющего собой натуральное ферментативное вещество, содержащее полный комплекс активных ферментов, включая и протеолитические ферменты, а также создание условий биохимической реакции, максимально приближенной к условиям пищеварения в живом организме, и определение количественного содержания пищевых белков по процентному расходу ферментов протеазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока позволяет повысить точность определения количественного содержания пищевых белков при одновременном устранении многоступенчатости процесса исследования и необходимости применения сложного оборудования и дорогих реактивов.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что предлагаемый способ определения количественного содержания пищевых белков отличается тем, что смешивание опытных образцов производят с ферментативным веществом в виде панкреатического сока, предварительно разбавленного стабилизирующим раствором до 50% концентрации при его соотношении с массой опытного образца субстрата 1:10, инкубирование подготовленной смеси ведут в течение 5-15 минут, перед проведением определения количественного содержания пищевых белков расчетным путем полученный в результате центрифугирования объем чистой жидкой фракции разбавляют стабилизирующим раствором в соотношении 1:100-200, при этом количественное содержание пищевых белков определяют как равное процентному расходу ферментов протеазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока. Кроме того, на стадии определения количественного содержания пищевых белков расчетным путем при необходимости дополнительно проводят оценку количественного содержания пищевых углеводов и жиров, при этом содержание пищевых углеводов определяют как равное процентному расходу ферментов амилазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока, а содержание пищевых жиров определяют как равное процентному расходу ферментов липазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока. Такое отличие от прототипа дает основание утверждать о соответствии предлагаемого способа критерию патентоспособности изобретения «новизна». Сравнение заявляемого способа определения количественного содержания пищевых белков не только с прототипом, но и с другими аналогичными техническими решениями в данной области не позволили выявить в них признаки, аналогичные отличительным признакам, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого способа условию патентоспособности изобретения «изобретательский уровень».

Предлагаемый способ определения количественного содержания пищевых белков осуществляют следующим образом.

В оптимальном режиме, установленном экспериментально, способ осуществляют следующим образом. Навеску опытного образца субстрата (100 мг), предварительно высушенную до воздушно-сухого вещества и измельченную, например зерно сельскохозяйственной культуры, до состояния муки или мясокостную муку смешивают с панкреатическим соком, предварительно разбавленным стабилизирующим раствором, в частности раствором Рингера, до 50% концентрации при его соотношении с массой опытного образца субстрата 1:10, т.е. 1 мл раствора панкреатического сока смешивают со 100 мг опытного образца субстрата. Полученную тщательно перетертую до однородной массы смесь выливают в три центрифужные пробирки, первая из которых предназначена для определения количественного содержания пищевых белков, вторая и третья пробирки могут быть использованы при необходимости определения количественного содержания пищевых углеводов и жиров. В отдельную четвертую пробирку выливают 1 мл раствора панкреатического сока 50% концентрации без добавления субстрата, предназначенной в качестве контрольной пробы. Инкубирование подготовленной смеси в первых трех пробирках и контрольной пробы раствора панкреатического сока в четвертой пробирке ведут в термостате при температуре 37°С в течение 10 минут по секундомеру. Температура 37°С является стабильной и соответствует нормальной температуре внутренних органов животных. Образовавшийся в первых трех центрифужных пробирках в процессе биохимической реакции, произошедшей в период инкубирования, ферментативно-субстратный комплекс подвергают центифугированию при 3000g в течение 2 минут. Полученные в результате центрифугирования объемы чистой жидкой фракции из каждой центрифужной пробирки сливают в отдельные три пробирки и затем разбавляют стабилизирующим раствором Рингера в соотношении 1:100. В этом состоянии и при этом соотношении, отвечающем условию оптимального соотношения субстрата с ферментами, содержимое в первых трех пробирках находится готовым для определения количественного содержания пищевых белков, углеводов и жиров. Четвертая пробирка, содержащая 1 мл раствора панкреатического сока 50% концентрации без субстрата и прошедшая стадию инкубирования, является обязательной в качестве контрольной пробы для применения на стадии определения количественного содержания пищевых белков, углеводов и жиров. Определение и расчет количественного содержания пищевых белков осуществляют по процентному расходу ферментов протеазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока и на основании известной методики расщепления казеина при фотометрическом контроле (Фотометрическое определение активности протеолитических ферментов в поджелудочной железе, соке по уменьшению концентрации казеина. Ц.Ж.Батоев Сб. научн. трудов Бурят. СХИ. 1971 г. №25, стр.122-126). Определение и расчет количественного содержания пищевых углеводов осуществляют по процентному расходу ферментов амилазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока и на основании известной методики оценки активности амилазы, т.е. по гидролизу крахмала (Сравнительная оценка сахарифицирующих и декстректирующих методов при определении активности амилазы в крови здоровых и больных острым панкреатитом. В.М.Мерина-Глузкинаю. Лаб. дело, 1965, №3, стр.143). Определение и расчет количественного содержания пищевых жиров осуществляют по процентному расходу ферментов липазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока и на основании известной методики гидролиза подсолнечного масла (Определение активности липазы панкреатического сока по гидролизу подсолнечного масла. Ц.Ж.Батоев, Г.Ц.Цыбекмитова. Болезни с-х животных в Забайкалье и на Дальнем Востоке и меры борьбы с ними. Благовещенск, 1985, стр.70-73).

Определив расчетным путем процентный расход ферментов протеазы, ферментов амилазы и ферментов липазы и руководствуясь известным научным положением о том, что молекулы указанных ферментов взаимодействуют исключительно только с молекулами пищевых белков, углеводов и жиров и строго в соотношении 1:1, можно констатировать, что в анализируемом субстрате количественное содержание пищевых белков равно процентному расходу ферментов протеазы, количественное содержание пищевых углеводов равно процентному расходу ферментов амилазы, количественное содержание пищевых жиров равно процентному расходу ферментов липазы. В частности из Таблицы 2 видно, что в оптимальном режиме 33% расхода ферментов протеазы равно 33% содержания пищевых белков, 54% расхода ферментов амилазы равно 54% содержания пищевых углеводов и 27% расхода ферментов липазы равно 27% содержания пищевых жиров, а из Таблицы 4 видно, что в мясокостной муке содержится белков 43,8%, жиров 7,99%, углеводов 0,78%.

Для практического осуществления заявляемого способа определения количественного содержания пищевых белков предлагается использовать в качестве ферментативного вещества панкреатический сок, получаемый в стационарных условиях от постоянных доноров, предпочтительно кур или других домашних птиц. В качестве эквивалентного по ферментативному составу заменителя панкреатического сока может быть использован гомогенат поджелудочной железы животных.

В экспериментальном режиме исследования проводились для определения оптимальной концентрации раствора панкреатического сока, оптимального соотношения раствора панкреатического сока к массе опытного образца субстрата, временного периода инкубирования и соотношения чистой жидкой фракции к раствору Рингера. Как показали данные экспериментов, отраженные в Таблице 1, оптимальная концентрация раствора панкреатического сока, необходимая для смешивания с субстратом опытного образца и проведения инкубирования, должна быть величиной 50%. Данные экспериментов, отраженные в Таблице 1, также дают основание сделать вывод о том, что оптимальным соотношением панкреатического сока 50% концентрации с массой субстрата опытного образца следует признать 1:10. Данные экспериментов, отраженные в Таблице 2, дают основание сделать вывод о том, что допустимый временной диапазон инкубирования, необходимый для осуществления оптимального биохимического взаимодействия ферментов протеазы, амилазы и липазы с субстратами опытных образцов, находится в пределах 5-15 минут. Данные экспериментов, отраженные в Таблице 3, дают основание сделать вывод о том, что оптимальным соотношением чистой жидкой фракции к раствору Рингера является 1:100-200.

Таким образом, как показывают экспериментальные данные, заявляемый способ определения количественного содержания пищевых белков, основанный на использовании панкреатического сока в качестве ферментативного вещества и определении количественного содержания пищевых белков, углеводов и жиров по показателю процентного расхода соответствующих ферментов на биохимическую взаимосвязь исключительно только с пищевыми белками, углеводами, жирами позволяет повысить точность определения количественного содержания указанных компонентов в пищевых продуктах при одновременном сокращении многоступенчатости и устранении необходимости применения сложного технологического оборудования и дорогих реактивов. Кроме того, предлагаемый способ обеспечивает возможность определять количественное содержание не только пищевых белков, но и пищевых углеводов и жиров.

Таблица 1 Сравнительные данные биохимического взаимодействия разной концентрации и объемов панкреатического сока с 0.1 г субстрата опытного образца (горох) Концентрация панкреатического сока, % 100 50 Объем панкреат. сока (мл) 1.0 2.0 3.0 1.0 2.0 3.0 Активность ферментов протеаз (мг/мл/мин) контрольный образец 435±4.5 440±4.5 440±5,6 223±5.6 270±3.37 280±2.25 Активность ферментов протеаз (мг/мл/мин) опытный образец 155±2.25 260±3.3 370±3,5 152±4.5 290±2.25 287±3.37 Разница между активностью ферментов в контрольном и опытных образцах, % 35.6 59,1 84,1 68.2 107.4 102.5

Таблица 2 Влияние времени инкубации на процесс биохимического взаимодействия ферментов панкреатического сока с субстратом опытных образцов при соотношении 1.0 мл раствора панкреатического сока к 100 мг субстрата опытного образца (горох) Время инкубации, мин 5 10 15 Образцы Контроль
ный Опыт
ный Расход ферментов, % Контроль
ный Опыт
ный Расход фрментов, % Контроль
ный Опыт
ный Расход фрментов, % Активность протеаз,
(мг/мл/мин) 150±10.6 200±20.6   210±18.6 140±10.1 33 140±10.1 100±8.3 29 Количество белков, %     -   33     29   Активность амилазы, (мг/мл/мин) 2280±125.6 1680±112.3 26.3 2280±150.2 1320±20.8 54 960±86.1 1320±95.7 - Количество углеводов, %   26.3 -   54     - - Активность липазы, (мг/мл/мин) 18±0.6 18±0.5 - 18±0.6 17.5±0.2 2.7 18±0.6 18±0.5 - Количество жиров, %     -   2.7     -  

Таблица 3 Влияние разного соотношения чистой жидкой фракции к раствору Рингера на свободную от ферментсубстратного комплекса ферментативную активность Соотношения чистой жидкой фракции к раствору Рингера Активность липазы, мкмоль/мл/мин Активность амилазы, мг/мл/мин Активность протеаз, мг/мл/мин Контроль Опыт Количество жира, % Контроль Опыт Количество углеводов, % Контроль Опыт Количество белков, % 1:50 5,0±0,2 5,0±0,1 - 2400±145,1 1600±95,7 33,3 270±17,1 220±12,8 18,5 1:100 15,0±0,3 14,5±0,1 3,4 2160±123,9 960±79,3 55,6 400±12,7 290±18,9 27,5 1:200 25,0±0,3 23,0±0,2 8,0 720±52,8 400±10,6 44,4 720±14,5 500±32,3 30,5

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии. Способ определения количественного содержания пищевых белков включает последовательно проводимые смешивание опытных образцов субстрата и ферментативного вещества в соединении со стабилизирующим раствором, инкубирование образованной смеси при температуре 37°С, центрифугирование ферментативно-субстратного комплекса и определение количественного содержания пищевых белков расчетным путем. В качестве ферментативного вещества используют панкреатический сок, предварительно разбавленный стабилизирующим раствором до 50% концентрации при его соотношении с массой опытного образца субстрата 1:10. Инкубирование подготовленной смеси ведут в течение 5-15 мин. Перед проведением определения количественного содержания пищевых белков расчетным путем полученный в результате центрифугирования объем чистой жидкой фракции разбавляют стабилизирующим раствором в соотношении 1:100-200. При этом количество пищевых белков определяют как равное процентному расходу ферментов протеазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока. Изобретение обеспечивает повышение точности определения количественного содержания пищевых белков в пищевых продуктах. 3 табл.

Способ определения количественного содержания пищевых белков, включающий последовательно проводимые смешивание опытных образцов субстрата и ферментативного вещества в соединении со стабилизирующим раствором, инкубирование образованной смеси при температуре 37°С, центрифугирование образовавшегося после инкубирования ферментативно-субстратного комплекса для получения чистой жидкой фракции и определение количественного содержания пищевых белков расчетным путем, отличающийся тем, что смешивание опытных образцов производят с ферментативным веществом в виде панкреатического сока, предварительно разбавленного стабилизирующим раствором до 50%-ной концентрации при его соотношении с массой опытного образца субстрата 1:10, инкубирование подготовленной смеси ведут в течение 5-15 мин, перед проведением определения количественного содержания пищевых белков расчетным путем полученный в результате центрифугирования объем чистой жидкой фракции разбавляют стабилизирующим раствором в соотношении 1:100-200, при этом количество пищевых белков определяют как равное процентному расходу ферментов протеазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока.