Способ приготовления тест-системы для оценки противовирусных конъюгатов Советский патент 1979 года по МПК A61B10/00 G01N33/16 

1

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при экспресс-диагностике вирусных заболеваний.

Известен способ приготовления тест-системы для оценки противовирусных конъюгатов путем присоединения к стабилизированным эритроцитам антигена 1.

, Однако известный способ не позволяет получить высокоакт1шные и специфтные тестсистемы, так как используемые химические посредники не способны избирательно реагировать как с вирусными, так и с клеточными антигенами.

Цепью изобретения является увеличение на поверхности эритроцитов числа рецепторов, способных избирательно соединяться со специфическими вирусными или клеточными антигенами.

Эта цель достигается тем, что 0,001-0,005%-иую суспензию стабилизированных эритрогдатов обрабатывают предварительно агрегированным глутаровым альдегидом специфическим гаммаглобул1шом в концентрации 0,005-0,05%, затем присоединяют гомологичный к активным

центрам антител агрегированного гамма-глобулина антиген и полученную тест-систему стабилизируют.

Способ осуществляют следующим образом.

Эритроциты О группы крови человека, отмытые от отрицательной реакции надосадочной жидкости с 50%-ной четыреххлоруксусной кислотой стабилизируют глутаровым альдегидом в конечной концентрации 0,25% при нейтральной рН и температуре 37°С в течение 3 ч.

Выделяют иммуноглобулиновую фракцию , из сыворотки крови кролика (с титром по FITA не менее чем 1:320 к вирусу гриппа Аг или В) методом осаждения сернокислым аммонием в концентрации 37,5% от насыщенного раствора в течение 6 ч при температуре 4 С с освобождением от соли методом гельфильтрации на сефадексе G - 25.

К 5 мл гамма-глобулина кролика, разведенного забуференным физиологическим раствором с рН 7,2 до концентрации белка 0,005- 0,05%, добавляют 0,3 мл 2,5%-ного глутарового альдегида и агрегируют при 37С в течение 1 ч, после чего добавляют 0,1-0,2 мл 0,5%-нь х гиутаризироваиных эритроцитов человекЕ и ирисоециняют к ним агрегированный гамма-глобулин при температуре 5б°С Б т ;чение 90 МШ1 н встр{О(ивании через каждъю 15-20 мин. После освобожде1гия от крупных агрегатов д.екантацией и отмьшки в физиологическом растворе нагруженные специфическим гамма-глобулином эритроциты выдерживают 4-17 ч при 4-25°С в аллашоисной вируссодер жащей жидкости: к 1-10 мл аллантоиеной В1фуссодержащей жидкости с титром по РГА с 1.%-ными куриными эритроцитами от 1:16 до 1:2048 добавляют эритрощпов. Результаты оценки иммунофлуоресцентной ИФ-активности флуоресцирующих антител, i;neцкфичных к гриппу АЗ и В, представлены на графике (см. чертеж), где : на оси абсцисс степень нагрузки в вибрионах на 1 эритродт; -Па оси ординат - ИФ-активность, выраженная :Величинами обратными исцользованиым разведениям конъюгатов; кривая А цоказывает зависимость специфиг еской ИФ-активности флу рас1глруюш,их антител (ФА) к грипггу А2 от степени нагрузки эритроцитов вирусом грип:пн Аа; кривая Б - зависимость специфичес:ко } ИФ-активности ФА к гриппу В от сгепе mi нагрузки эритроцитов вирусом гриппа В; кривая В -- зависимость перекрестной ИФ-актттености ФА к гриппу А2 от степени нагрузкк :эритроиитов вирусом гриппа В; кривая зависимость перекресттюй ИФ-активиости ФА к гриппу В от степени нагрузки эритроцитоз вирусом гриппа А2 Из представленных; данных видно, что. ИФ-активность противогриппозных конъюгатов |Наход1Ггс.я в ггрямой зависимости от количества вибрионов в использованной тест-системе. Максимальное кол}шество вируса, присоедине -шое к эргггроцитам с помощью предлагаемого способа, составляет для гриппа В 2- .4 тысячи, для rpimna А2 8-16 тысяч вибрионов на 1 эритроцит (теоретически возможная нагрузка эритроцитов, при условии распотюже ния вибрионов в один слой, в пределах 5- 20 тысяч вибрионов на 1 эритроцит). Einaro ;даря использованию тест-системы с болыиим количеством вируса удается выявить не значитетьную перекрестнута активность оцениваеглых конъюгатов. С помощью полученных тест-препаратов можно дать достаточно полную характеристику изучаемь.м конъюгатам, которая включает в себя: чувствительность и перекрестн тс. активность иммуиофлуоресцентных реакций в зависимости от взятого рабочего разведения конъюгата, титры специфической и, неспеилфической ИФ-активпости оцениваемых конъюгатов. Предлагаемый способ позволяет получить достаточный набор специф1-1чпых и с необходимым количеством присоединенного антигена лиофнлизированных тест-систем, пригодных для оценки красящей акт5шности, специфичности, и выбора оши:мального рабочего разведения противовируспых конъюгатов не только в процессе их производства, но и в конкретных устовиях работы вирусологических лабораторий (оптические системы люминесцентных микроскопов, светофильтры, источники ультрафиолетового света). Приготовление тест-систем упростит и ускорит контроль конъюгатов. гтовысит эффектт1ность экспресс-диапюстики вирусных заболеваний. Формула изобретения Способ приготовления тест-системы для оценкн 1фотивовируснь х конъюгатов путем присоедт;еБля к стаби тизировапным эритроцитам аптигена, о т ТЕ и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью уветичеиия на аойсрхности эритроцитов числа рецепторов, способных избирательно соединяться со специфшескими вирусными или клеточными антигенами, 0,001-0,005% -пую суспе.чзию стабилизировагмых эритроцитов обрабатывают предварительно агрепфованным rjEyxapoBbiiM альдегидом специфически. гаммаглобулином в ко1-щентрадии 0,005-0,05%, затем присоединяют гомологичггый к активпым центрам антшел агрегированного гамма-глобулина антиген и полученную тест-систему стабилизиРЗ-ТОТ. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. П.агава И. И. Оценка иммунофлуоресцептной активности ФА и иммунных сывороток Ггротив возбудотелей ОЮ с помощью эритроцигарных тест-объектов. Канд. дне. Л., 1972.

60 12JO 2SCSGO 1 Z t В 1S fTjbie тыс тис тм тыс