СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТОК, СОДЕРЖАЩИХ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ВИРУСА МАРБУРГ Российский патент 1997 года по МПК A61K39/42 

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при получении сывороток против вируса Марбург, необходимых в вирусологических исследованиях, а также при производстве диагностических средств.

Вирус Марбург является возбудителем особо опасной вирусной инфекции. Случаи массовых заболеваний, ранее отмеченные в Европе, были следствием контакта человека с инфицированными животными, завезенными с Африканского континента. Последние данные говорят о возможно более широком распространении филовирусов в природе и о высокой вероятности инфицирования работников вивариев и карантинных служб [1] Поэтому существует актуальность разработки диагностических средств, в частности по выявлению антител к вирусу Марбург, для контроля импортируемых обезьян на их возможный контакт с вирусом Марбург и регулярного обследования персонала, непосредственно работающего с приматами. При этом необходимо получение сывороток, содержащих антитела к вирусу Марбург, т. к. они являются одним из основных компонентов диагностических тест-систем.

Известен способ получения противовирусных сывороток, например, антирабической сыворотки [2] включающий 6-кратное введение лошадям-донорам возрастающих доз инактивированного антигена вируса бешенства с последующим 1 - 8-кратным инфицированием активным вирусным материалом до получения титра специфических антител в крови животного 1 500 и выше в реакции нейтрализации (против 100 LoD₅₀ вируса бешенства, штамм СVS).

Однако, гипериммунные сыворотки лошадей не всегда могут быть использованы в диагностических целях. Выявление антител к вирусу Марбург наиболее актуально у обезьян, импортируемых из Африки и Юго-Восточной Азии, а также при заболевании людей геморрагическими лихорадками неустановленной природы. В иммуноферментных тест-системах, предназначенных для выявления антител в крови приматов и человека, использование лошадиных сывороток в качестве контрольных положительных образцов невозможно, так как, во-первых, по отношению к ним нельзя использовать конъюгат на основе белка A [3] во-вторых, видовое различие между исследуемыми антителами (антитела человека и приматов) и контрольными образцами (антитела из лошадиных сывороток) не позволяют использовать в таких тест-системах единый антивидовой конъюгат.

Известен способ иммунизации морских свинок инактивированным антигеном вируса Марбург [4] Сравнительное изучение некоторых иммунологических показателей при введении инактивированного вируса Марбург морским свинкам (Вопр. вирусол. 1991. N 5. с. 421 424), включающий: 2х-кратную, с интервалом 14 сут, иммунизацию морских свинок препаратом, содержащим инактивированный антиген в количестве 6 7 мкг специфического белка на одну дозу; забор крови у животных на 28 сут и последующее определение уровня специфических антител с использованием иммуноферментного анализа (ИФА).

Недостатком способа является низкий титр специфических антител в крови животных, в среднем составляющий 1 320.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ получения иммунной сыворотки к вирусу Марбург [5] Способ включает 2х-кратную, с интервалом 21 дн, иммунизацию морских свинок активным вирусным материалом, содержащим в одной дозе живой вирус в количестве 10000 БОЕ и полный адъювант Фрейнда, с последующим забором образцов крови и определением уровня антител в реакции иммунофлуоресценции и в ИФА.

Способ позволяет получить сыворотки с высоким уровнем антител к вирусу Марбург, однако, имеет ряд недостатков. Использование иммунных сывороток морских свинок в качестве контрольных при постановке ИФА по определению уровня антител к вирусу Марбург в крови человека и обезьян дает возможность подтвердить работоспособность метода, однако не позволяет адекватно оценить его чувствительность и специфичность, так как, с одной стороны, в случае использования конъюгата на основе белка A имеет место эффект различной эффективности его связывания с антителами от животных, относящихся к разным биологическим видам, и, с другой, при проведении ИФА в этом случае нельзя использовать единый, один и тот же, антивидовой конъюгат [3]
Другой недостаток заключается в том, что морские свинки являются высокочувствительными к заражению вирусом Марбург. Небольшие дозы вируса, как правило, приводят к гибели животных [6] причем даже в случае, если они были предварительно иммунизированы инактивированным антигеном [7] Некоторые показатели иммунитета у животных, иммунизированных инактивированным вирусом Марбург, после заражения гомологичным вирусом (Вопр. вирусол, 1994, N 1. с. 13 17). При использовании для иммунизации морских свинок активного вируса выживают лишь отдельные из животных, причем практически невозможно предсказать, какое количество особей перенесет заболевание. Кроме того, использование морских свинок в качестве животного-донора малоэффективно из-за малого количества крови, которое можно взять даже в случае тотального забора.

Задачей предлагаемого технического решения является получение таких сывороток, содержащих антитела к вирусу Марбург, в том числе гипериммунных, с высоким титром специфических антител, которые позволяют более адекватно оценивать чувствительность и специфичность тест-систем, а также могут быть включены в их состав в качестве контрольных положительных образцов.

Поставленная задача решается тем, что способ включает предварительную иммунизацию животных-доноров инактивированным антигеном для достижения необходимого защитного уровня специфических антител и последующее инфицирование активным вирусом. В качестве животных-доноров используют обезьян Cercopithecus aethiops. Для иммунизации используют очищенный инактивированный формалином антиген, приготовленный согласно способу [8] Препарат вводят внутримышечно 2-3-кратно с интервалами, соответственно, 14-30 дн. При первом введении используют полный, а при 2-м и 3-м неполный адъювант Фрейнда. Разовая доза содержит 20-100 мкг общего вирусного белка.

Если титр специфических антител в крови, определенный в ИФА, превышает через месяц после 2-го или 3-го цикла иммунизации 1 640, считают, что животное может быть инфицировано активным вирусом. В качестве вирусного материала используют гомогенат печени морской свинки, инфицированной вирусом Марбург. Концентрацию вируса в этом материале определяют титрованием на морских свинках и выражают в LD₅₀/мл. При первом инфицировании обезьяны доза вводимого вируса составляет 1 10 LD₅₀. Начиная с 14 дня после инфицирования у животного берут образцы крови с интервалом 5 10 дн. Если через месяц наблюдения отмечается рост титра антител более, чем в 2 раза, животное можно повторно инфицировать дозой 10 100 LD₅₀, с последующим забором образцов крови. Из полученных образцов сывороток, после их анализа в ИФА, формируют панель заведомо положительных образцов, взятых в динамике антителообразования. Животное содержат для дальнейшего использования в качестве донора или забивают с целью тотального забора крови.

Новыми, отличительными от прототипа, являются следующие признаки способа. В качестве животных-доноров используют обезьян Cercopithecus aethiops. Иммунизацию проводят путем 2-3-кратного введения животным препарата, содержащего 20 100 мкг очищенного инактивированного антигена и адьювант Фрейнда. Для получения сывороток с высоким содержанием антител к вирусу Марбург животных, имеющих после иммунизации титр специфических антител в ИФА не менее 1 640, дополнительно инфицируют одно или двукратно активным вирусом Марбург, причем при первом заражении доза вводимого антигена составляет 1 10 LD₅₀, а при втором 10 100 LD₅₀.

Сравнение заявляемого способа с известными аналогами показало, что отличительные от прототипа признаки проявляют новые, неизвестные ранее свойства, выявленные в процессе экспериментов, а именно:
1. Доза инактивированного антигена 20 100 мкг, вводимого обезьянам Cercopithecus aethiops на стадии предварительной иммунизации, обеспечивает необходимую эффективность антителообразования. Уменьшение дозы снижает уровень антител в крови животного, а увеличение повышает реактогенность препарата без существенного увеличения титра специфических антител. 2-3-кратное введение препарата обеспечивает получение защитного уровня антител к вирусу Марбург 1 640 у не менее, чем 75% животных.

2. Доза заражения 1 10 LD₅₀ позволяет вызвать экспериментальное заболевание у иммунизированного животного, которое оно переносит в легкой форме или бессимптомно. Превышение этой дозы при первом инфицировании или инфицирование данной дозой без предварительной иммунизации может привести к гибели животного в течение 7 16 дн. При повторном инфицировании, которое можно осуществлять только в случае положительного иммунного ответа на первое заражение, введение вируса дозой 10 100 LD₅₀ позволяет получить гипериммунные сыворотки с титром по ИФА до 1 12800 и выше. Превышение этой дозы также может вызвать гибель животного.

Использование в качестве животных-доноров обезьян позволяет получать сыворотки, которые могут быть использованы в диагностических целях как один из компонентов тест-систем для выявления антител к вирусу Марбург в крови и приматов, и человека, так как в обоих случаях при постановке ИФА можно использовать антивидовой конъюгат, что повышает чувствительность и специфичность метода.

Предлагаемая схема иммунизации обезьян позволяет получить набор сывороток, взятых на начальных стадиях иммунизации, а также в динамике антителообразования после инфицирования животного, существенно отличающихся по количественному содержанию специфических антител. Гиперимунные сыворотки могут быть использованы как компонент тест-системы, а сыворотки, взятые в динамике антителообразования для получения панели положительных образцов, необходимой при оценке чувствительности диагностических средств. Получение такой панели при разработке тест-систем необходимо и актуально, так как болезнь Марбург не эндемична для большинства стран мира и России, и отсутствует возможность постоянного получения подобных образцов от животных в полевых условиях и от людей, переболевших в результате естественного инфицирования.

Несмотря на то, что известен подход к получению иммунных сывороток, основанный на предварительной иммунизации животных инактивированным антигеном с последующим введением активного вируса [2] отличительные признаки заявляемого способа основана на новых количественных критериях иммунизации и инфицирования обезьян вирусом Марбург, что позволяет сделать вывод о соответствии данного изобретения критерию "уровень техники".

Способ получения сывороток, содержащих антитела против вируса Марбург, осуществляют следующим образом.

Так как способ включает предварительную иммунизацию, животных и их последующее инфицирование с целью образования в крови специфических антител, на всех этапах получения сывороток необходимо количественное определение в них уровня антител к вирусу Марбург. Для этой цели был использован наиболее чувствительный метод ИФА, который проводили по следующей методике.

Пример 1. Проведение твердофазного ИФА по выявлению антител к вирусу Марбург в крови обезьян и человека.

Очищенный вирусный антиген получают из плазмы крови морских свинок, инфицированных вирусом Марбург, например штаммом Рорр, согласно способу [8] и инактивируют добавлением додецилсульфата натрия до конечной концентрации 2% и прогреванием в течение 1 мин при 100^o Полученный вирусный лизат разводят карбонатным буферным раствором pH 9,6 до концентрации 2,0±0,5 мкг/мл. В качестве твердой фазы используют 96-луночный планшет для иммунологических реакций фирмы "Титертек", Финляндия, или аналогичный, импортного или отечественного производства.

В каждую лунку планшета вносят по 50 мкл раствора антигена, планшет выдерживают 18 ч при температуре 4^oC. Затем раствор удаляют, а лунки планшета промывают 0,1 М фосфатным буферным раствором pH 7,3, содержащим 1% твин-20, (ФБР-Т). Для блокировки свободных центров пластика в каждую лунку вносят по 100 мкл 4% раствора бычьего сывороточного альбумина в ФБР-Т и выдерживают 60 мин при 37^oC. После удаления блокирующего раствора планшет высушивают на воздухе.

Анализ проводят следующим образом:
1) готовят разведения исследуемых сывороток, начиная с начального 1 80 или 1 100, и далее с двух- или четырехкратным интервалом разведения;
2) вносят по 50 мкл: исследуемые сыворотки в лунки соответственно разведениям; образец контрольной положительной сыворотки, заведомо содержащей антитела к вирусу Марбург, (K+) в 2 3 лунки; образец контрольной отрицательной сыворотки, заведомо не содержащей антитела к вирусу Марбург, (K-) в 2 3 лунки; конъюгат (контроль) в 2 3 лунки. Инкубируют 1 ч при 37^oC, после чего все образцы удаляют и лунки планшета промывают ФБР-Т;
3) во все лунки планшета вносят по 50 мкл рабочего разведения конъюгата, меченного пероксидазой хрена, выдерживают 1 ч при 37^oC, после чего конъюгат удаляют, а лунки снова промывают ФБР-Т;
4) вносят индикаторный раствор (0,05 М цитратный буферный раствор pH 5,0, содержащий 0,5% чортофенилендиамина и 0,1% перекиси водорода), планшет выдерживают в темноте 15 мин при комнатной температуре, после чего реакцию останавливают добавлением в лунки по 25 мкл 2 М раствора серной кислоты.

Учет результатов ИФА проводят путем измерения оптической плотности (ОП) лунок планшета при длине волны 492 нм. Результаты считывают в том случае, если среднее значение ОП в контроле конъюгата не более 0,15; ОП K-, в разведении 1 100, не более 0,2. Титр специфических антител в исследуемых образцах численно выражают как предельную кратность разведения сыворотки, для которой измеренная ОП превышает более, чем в 2,1 раза ОП для того же разведения парной отрицательной сыворотки или, при отсутствии таковой, ОП для того же разведения K-.

Пример 2. Схема иммунизации животных.

В качестве животных-доноров берут 4-х половозрелых обезьян Cercopithecus aethiops, выращенных и содержащихся в условиях питомника лабораторных животных (животные N 1 4, см. таблицу). До начала процедуры иммунизации у них берут по 3 5 мл крови и получают образцы исходных сывороток.

Для иммунизации используют очищенный инактивированный формалином антиген, приготовленный согласно способу [8] Препарат, содержащий в 0,5 мл 50±30 мкг антигена, смешивают 1 1 с полным адъювантом Фрейнда и вводят животным внутримышечно. Повторную иммунизацию проводят через 14 сут, используя неполный адъювант Фрейнда. Через месяц после второй иммунизации в крови животных определяют в ФА изменение уровня специфических антител к вирусу Марбург по сравнению с исходными образцами (см. пример 1). Например, у животных N 1 и 2 титр специфических антител больше или равен 1 640, их переводят в инфекционное отделение вивария для последующего инфицирования. У животных N 3 и 4 титр антител меньше 1 640, им проводят 3-й цикл иммунизации, используя препарат с неполным адъювантом Фрейнда. Через месяц после 3-й иммунизации у животных снова определяют в ИФА титр специфических антител. Например, у животного N 3 титр специфических антител стал равен или больше 1 640, его также переводят в инфекционное отделение вивария для последующего инфицирования. У животного N 4 титр антител остался меньше 1 640, это животное инфицированию не подлежит и его используют как донора для получения образцов сывороток с низким содержанием специфических антител.

Пример 3. Получение сывороток от инфицированных животных.

В качестве материала для заражения обезьян берут 10%-ный осветленный гомогенат печени морских свинок, инфицированных вирусом Марбург. В материале предварительно определяют концентрацию активного вируса, для чего проводят процедуру титрования на морских свинках. Концентрацию вируса выражают в LD₅₀/мл. Перед заражением обезьян исходный гомогенат разводят физраствором из расчета, чтобы конечная концентрация вируса в материале, используемом при первом инфицировании, составляла 10 LD₅₀/мл, а при втором 100 LD₅₀/мл.

Животных N 1, 2 и 3, имеющих титр специфических антител не менее 1 640 (см. пример 2), инфицируют внутрибрюшинно, вводя 0,1 1,0 мл вирусного материала с титром 10 LD₅₀/мл. Начиная с 14 дня после инфицирования у животных берут образцы крови с интервалом 5 10 дн и определяют титр антител к вирусу Марбург в ИФА. Например, через месяц наблюдения у животных N1 и 2 отмечено увеличение концентрации антител более, чем в 2 раза, тогда считают, что этих животных можно использовать для получения гипериммунных сывороток и повторно инфицируют дозой 10 100 LD₅₀, вводят 0,1 1,0 мл материала с титром 100 LD₅₀/мл, с последующим забором образцов крови с интервалом в 10 15 дн.

Пример 4. Получение панели положительных сывороток, необходимость для оценки чувствительности тест-систем, предназначенных для выявления антител к вирусу Марбург в крови человека и обезьян.

Все образцы сывороток с титром антител 1 320 и выше инактивируют прогреванием, добавляют консервант (мертиолят натрия в конечной концентрации 0,005 0,01% ). Для получения панели положительных сывороток берут по 1 мл каждого образца, добавляют 0,5 1,0 мл 10 20%-ного раствора пептона или другой наполнитель, обладающий стабилизирующими свойствами, материал разливают в ампулы или флаконы по 100 200 мкл и затем лиофилизируют. После процедуры высушивания у образцов определяют титр антител в ИФА. В состав панели включают все образцы с титром 1 160 и выше. В таблице приведены результаты получения панели положительных образцов сывороток от 4-х обезьян, иммунизированных в лабораторных условиях согласно примерам 2 и 3.

Данный набор контрольных сывороток позволяет проводить оценку чувствительности диагностической тест-системы как при ее производстве, так и в ходе проведения анализов.

Пример 5. Получение контрольных положительных образцов сывороток для тест-системы.

Берут гипериммунные сыворотки с титром антител 1 6400 и выше, объединяют, инактивируют прогреванием, добавляют консервант (мертиолят натрия в конечной концентрации 0,005 0,01% ). Фасуют в жидком виде или высушивают в соответствии с инструкцией по изготовлению тест-системы, после чего определяют титр антител к вирусу Марбург в ИФА.

Промышленная применимость изобретение может быть использовано при производстве диагностических средств для целей здравоохранения и ветеринарии.

Источники информации
1. Morbid and Mortal. Weekly Rept. 1990, 39, N 24, р. 404 405.

2. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. Под ред. П.Н. Бургасова, М. Медицина, 1978, с. 308 315.

3. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций. Под ред. Т.В. Парадзе и П. Халонена, М. Медицина, с. 147.

4. Игнатьев Г.М. Агафонов А.П. Стрельцова М.А. и др. Сравнительное изучение некоторых иммунологических показателей при введении инактивированного вируса Марбург морским свинкам // Вопр. вирусол. 1991. N 5, с. 421 424.

5. Андаев Е.И. Куликова Е.В. Новожилов С.С. и др. Получение и характеристика иммунных сывороток к вирусам Марбург и Эбола//ДЕП. в ВИНИТИ 22.05.92, N 1697-В92/реф. опубл. в РЖ 04Б1. Вирусология, N9, 1992. М. ВИНИТИ, с. 32.

6. Гончар Н.И. Пшеничнов В.А. Походяев В.А. и др. Чувствительность к вирусу Марбург различных экспериментальных животных// Вопр. вирусол. 1991, - N 5, с. 435 437.

7. Игнатьев Г.М. Стрельцова М.А. Агафонов А.П. и др. Некоторые показатели имунитета у животных, иммунизированных инактивированным вирусом Марбург, после заражения гомологичным вирусом// Вопр. вирусол. 1994, N 1, с. 13 17.

8. Патент СССР N 1808013, МКИ⁵ C 12 N 7/00, опубл. 07.04.93.

Использование: вирусология и биотехнология, в вирусологических исследованиях и при производстве диагностических средств, может быть использовано при получении сывороток против вируса Марбург. Сущность изобретения: способ включает двух- или трехкратную иммунизацию обезьян Cercopithecus aethiops очищенным инактивированным вирусным антигеном с адъювантом Фрейнда для достижения в крови животных необходимого уровня антител к вирусу Марбург с титром по ИФА не менее 1 : 640 и последующее инфицирование, которое проводят одно- или двухкратно, причем доза при первом заражении составляет 1 - 10 LD₅₀, а при втором - 10 - 100 LD₅₀. 1 табл.

Способ получения сывороток, содержащих антитела против вируса Марбург, включающий иммунизацию животных-доноров путем введения в их организм препарата, содержащего вирусный антиген с адъювантом Фрейнда, с периодичностью и количеством доз, достаточных для образования в крови животных специфических антител, и последующий забор образцов крови с анализом уровня антител в ИФА, отличающийся тем, что в качестве животных-доноров используют обезьян Cercopithecus aethiops, иммунизацию проводят сначала путем двух- или трехкратного введения препарата, содержащего в одной дозе 20 100 мкг очищенного инактивированного антигена, до достижения в крови животных уровня антител к вирусу Марбург с титром в ИФА не менее 1 640, после чего обезьян одно- или двухкратно инфицируют активным вирусом Марбург, причем доза при первом заражении составляет 1 10 LD_5 0, а при втором 10 100 LD_5 0.