-Пептидилтиогликозиды ацетил- -глюкозамина в качестве лигандов в аффинной хроматографии Советский патент 1979 года по МПК C07H15/14 C07G7/02 

(54) Р-ПЕПТИДИЛТИОГЛИКОЗ ИДУ Ы-АЦЕТИЛ-В-ГЛЮКОЗАМИНА В КАЧЕСТВЕ ЛИГАНДОВ В АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Настоящее изобретение относится к новым соединениям - f -пептидилти гликозидам N-ацетил-п-глюк6замина общей формулы 1а: -oe-R KOH) НОН-к HNtOCJtj I R - CHiCONHCHjiCONHCHiCONH II R - CH2CONHCHiCONHCH2.CONH fcoNHNH III R - CH CONHNH, JYR - CHjCONHNHCocHj CH cooH в качестве лигандов в аффинной хроматографии. (Ь-Пептидилтиогликозиды N-ацетил-D-глюкозамина являются конкурентны ми ингибиторами К-ацетил-(Ь-В-гексозаминидазы (К.Ф. 3.2.1.52) и могут быть использованы в. качестве биоспе цифических лигандов в аффинной хром тографии и при изучении механизма действия этого фермента, а также в биоспецифической хроматографии М-ац тил 0-глюкозамнн специфических лект нов. Известны S- и N-алкил- и арилгликозиды Ы-ацетил-В-глюкозамина 1), применяющиеся в аффинной хроматографии N-ацетил-р)-О-гексозаминидазы (К.Ф. 3.2.1.52). Агликоновая часть указанных р -гликозид6в Н-ацетил-р -глюкозамина представляет собой молекулы гидрофобного характера. Это обстоятельство препятствует использованию таких биосцецифических лигандов в аффи.нной хроматографии N-ацетил-|Ь-П-гексозаминидазы из-за большого сродства Этого фермента к гидрофобным молекулам, присоединенным к водонерастворимым полимерам. Высокая способность К-ацетил-В-гексозаминидазы связываться с указанными лигандами приводит к необходимости использовать при элюции этого фермента буферы со щелочным зна-Чением рН- (рН 8-10) , что приводит к возможной инактивации фермента во время элюции. Кроме того наличие в известных р -гликозидаХ концевых амино- и карбоксильных групп дает возможность присоединять эти соединения только к бромциан-активированным полимерам, что приводит к-получению сорбентов

с сильновыраженными ионнообменными свойствами -.2.,

Целью настоящего изобретения является получение новых Ь-пептидилтиогликозидов N-ацетилгD-глюкозамина общей формулы-ia, в качестве лигандов в аффинной хроматографии, которые представляют собой гликопептиды природного строения, не содержащие агликоны с гидрофобными свойствами.

Природное строение описываемкк гликоггептидов позволяет исключить побочные явления при использовании их в качестве лигандов в аффинной хроматографии и расширить арсенал биоспецифических сорбентов.

Данные соединения можно получить путем ряда превращений хлоргидрата 2-S ,2 -дидезокси-1 -Ейо-2 -ацетамидо-3 ,4 ,б -три-О-ацетил- П глюкопирацозил)-2-псевдотиомочевины, который алкилйруют монобромуксусной кислотой в водно-ацетоновом растворе карбоната калия и бисульфата натрия и получают 8-карбоксим.ет1от7Д--г2-дидезркси-1-тио-2-ацетамидо-3,Т, J-три-О-ацетил-|5-0-тлюкопйраноз ид, При алкилировании исходного соединен ния этиловым эфиром монобромуксусной кислоты в этих же условиях получают этиловый ЭФИР 2-карбоксиметил-1,2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-3,4,6-три-О-ацетил-р-П-глюкопиранозида. Затем проводят конденсацию S-карбоксиметил-1,2-дйдезокси-1-7ТИО-2-ацетамидо-3,4,6-три-О-ацетил-р-П-глюкопиранбзида с метиловыми эфирами глидилглицина и триглицина в воднотетрагидрофурановом растворе, например в присутствии карбодиимида.

Выделенные метиловые эфиры S-Xl/2-дидезйксй-с1-тио-2-ац«тамидо-3, 4,6-три-О-ацетил- р-О-глюкопиранозил} -тиоацетилглицилглицина и S-(i,2-дидезокси-1-тио- ацетамидо-3,4,6-три-0-ацётил-р -П-глюкопиранозил) -тиоацетилглидилглицилглицина обрабатывают безводным гидразином в абсолютном метаноле и получают соответствующие дезацетилйрованные гидразиды I; и II Гидразицолизом в этих же условиях, этилового эфира 8-карбоксиметил-1,2-дидезокси-1-тио-2-аце3 амидо-3 ,4,6-три-Отацетил- |Ь-О-глюко11Ираноз ида пОлучают Б-(1,2-дидезокси-2-тио-2-ацетамидсн ft-D-глюкопиранозил)-тиоацетилгидаазид III. Сукцинилированием соединения III янтарным ангидридс л в водно-метанольном растворе получают N-сукцинилгидразид 5-(1,2-дидезокси-1-тио-2-ацетам идо-(i-D-глюк опиранозил)-тиоуксусной кислоты (1У),

Пример. Для синтеза | -петидилтиогликозидов Ы-ацетил-В-глюкоза. мина необходимо получить следующие исходные соединения:

702030i

К раствору 2 г (4,5 ммоля) хлоргидрата 2-S-(l ,2 -дидезокси-l-тио5 -2-ацетамидо-3,4 , б-три-О-ацетил-|)-В-глюкопиранозил) -2-псевдотиомочевины в 16 мл водно-ацетоновой смеси (1:1) прибавляют при перемешивании 0,75 г (5,3 ммоля) монобромуксусной 0 кислоты, 1,8 мл 2,7 М раствора (4,8 ммоля) бисульфата натрия и

5 - (с 0,39, хлороформ). Выход

На.йдено,%: С 45,62; Н 5,67; N 3,03; S 7,60; .

0 Вычислена,%: С 45,59; Н 5,59; N 3,32; S 7,60..

2,Метиловый эфир S-(1,2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-3,4,б-три-О-аце. тил-(Ь-В-глюкопиранозил)-тиоацетил5 глиц ил глицина. ..

К раствору 0,35 г (1,9 ммоля) хлоргидрата метилового эфира глицилглицина в 25 мл 90% водного тетрагидрофурана прибавляют 0,32 мл 0 (2,2 ммоля) триэтиламина, 1 г

,(2,3 ммоля) 3-карбоксиметил-1,2-ди- . дезокси-Г-тио-2-ацетамидо -3, 4,6-три-О-ацетил- -П-глюкопиранозида и 0,66 г (3,2 ммоля) дициклогексилкар5 бодиимида. Реакционную смесь перемешивают 2 ч при 2-5° и 16 ч при 2022, добав.ляют 25 мл воды и выпавшую дициклогексилмочевину удаляют фильтрованием. Объединенный фильтрат и 0 промывные воды экстрагируют хлороформом (3x15 мл), органический слой прся швают 3%-ным раствором (15 мл) бикарбоната натрия, разбавленной соляной кислотой (15 мл) и водой 5 (15 мл). Сушат над безводным сульфатом натрия, хлороформ упаривают и остаток хроматографируют на колонке с силикагелем (15-1 см). Колонку последовательно прс 1ывают эфиром, .Q смесью этилацетата с эфиром и этилсщетатом. Фракции, элюированные этилацетатом и содержащие продукт реакции, объединяют, растворитель упаривают досуха и остаток кристаллизуют из эфира. Полученный метиловый эфир S-(1,2-дидеэокси-1-тио-2-ацетамидо-3, 4, 6-три-О-ацетил-|У-П-глюкопираноэил)-тиоацетилглицилгли цина имеет т.пл, 163°/ot/|,° - 44,5 (с 0,25, этанол). Выход 1 г (79%). Найдено,%: С 46,23j Н 6,02; . N 7,19; S 5,56. С21 Н, S . Вычислена,%: С 45,91; Н 5,69; N 7,65; S 5,83. 3. Метиловый эфир S-(1,2-дидезок си-1-тио-2-ацетамидо-3,4,6-три-О-а:цетил-рг1)-глюкопиранозйл)-тиоацетилглицилглицилглицина. . Условия получения и выделения ко нечного продукта аналогичны п. 2. Из 0,7 (2,3 ммоля) хлоргидрата мети лового эфира глицилглицилглицина, 0,32 мл (2,.3 ммоля) триэтиламина,. 1 г (2,3 ммоля) 8-карбоксиметил-1,2 -дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-3,4,6-три-О-ацетил-} -В-глюкопиранозида и 0,66 (3,2 ммоля) дициклогексилкарбо дии(«ида получают метиловый эфир S-(1,2 дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-3,4,б-три-О-ацетил-р-О-глюКопиранозил) -тиоацётилглицилглицилглицина т.пл. 187-188° /с(./|° - 107,5(с 0,23 этанол). Выход 1 г (72%). . Найдено,%: С 46,05; Н 5,42; N 9,16; S 5,12; . Вычислено,%: С 45,77; Н 5,18; N 9,28; S 5,31. 4. Этиловый эфир 5-.(1,2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-3,4,6-три-О-ацетил-(У-О-глюкрпиранозил)-тиоуксу Кой, кислоты. К раствору 29 г (65 ммоля) хлор.гидрата S- (1, 2-дидезокси-1-тио-2-ац тамидо-3,4,6-три-О-ацетил-р-В-глюко пиранозил)-псевдотиомочевины в 2бО водно-ацетоновой смеси (1:1) при пе ремешивании прибав.ляют 8,6 мл (73 ммоля) этилового эфира монобром ; уксусной кислоты, 24 мл 2,7 М раств ра (65 ммоля) бисульфита натрия и 8,9 г (65 ммоля) карбоната калия. Смесь перемешивают 2 ч при 20-22, разбавляют 150 мл воды и продукт ре акции экстрагируют хлороформе. Экстракт прерывают 3%-ным раство ром бикарбоната натрия (30 мл) водой и сушат над безводным сульфате натрия. Хлороформ упаривают и остаток .кристаллизуют из 33% водного ме танола. Полученный этиловый эфир S-карбоксиметил-1,2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-3, 4, 6-три-О-ацетил-(Ь-D-глюкопиранозида имеет т.пл. 158 - 70 (с 1, этанол). Выход 28 г (97%) . Найдено,%: С 47,91; Н 6,14; N 3,12; S 7,13. CieH i QloSВычислено,%: С 48,10; Н 6,05; N 3.12; S 7,09. Затем проводят синтез непосредственно (-пептидилтиогликозидов N-ацетил-П-глюкозамина. I.Гидразид 8-(1,2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-(%-0 5люКопиранозил) -тиоацетилглицилглицина. К раствору 1. г (1,3 ммоля) метилового эфира S-(1,2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-3,4,6-три-О-ацетил-p-D-глюкопиранозил)-тио-ацетилглицилглицина в 10 мл абсолютного метанола при перемешивании прибавляют 0,3 мл (l0,8 ммоля) безводного гидразина. Смесь перемешивают при 20-22 в течение 20 ч. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают абсолютньпи метанолом и сушат. Полученный продукт реакции имеет т.пл. 219-220 /сС/| - 103 (с 0,13, метанол: вода 2:1), Выход Of68 г. (89%). .-найдено,% С 39,98; Н 6,08; Ы 16,48; S 7,40. С 4Н25«50вЗ. Вычислено,%: С 39,70; Н 5,96; N 16,54; S 7,57. II.Гидразид 5-(1,2-дидезокси-1-тио-2-аце;гамиДо-|Ь-С-глюкопиранозил) -тиоацётилглицилглицилглицина. Гидраяинолизом 1 г (1,6 ммоля) метилового эфира S-(l,2-дидeзoкcи-l-тиo-2-aцeтaмидo-3, 4,б-три-0-ацетил-р-В-глюкопиранозил)-тиоацётилглицилглицилглицина в условиях, аналогичных П.1, указанный продукт т.пл. 225-226°, 47(0 0,18, метанол:вода - 2:1). Выход 0,58 г (75%).. Найдено,%: С 40,22 Н 5,98; N 17,73; S 6,82. С бНгвНбО,8. Вычислено %: С 39,99; Н 5,88; N 17,49; S 6,67.. III.Гидразид 3-карбоксиметил-1,2-дидезокси-1-тио-ацетамидо-|Ь-О-глюкопиранозида. . Гидразинолизом 4,5 г (10 ммолей) этилового эфира 5-карбоксиметил-1-тио-2-ацетамндо-3,4,6-три-О-ацетш1.,((-О-глюкоП1 ранозида в условиях, аналоги ных п. 1, получают указанный продукт, т.пл. 247-249, 58° (с 1, вода.). Выход 3,0 г (96%). Найдено,%: С 3.8,99; Н 6,12; N 13,55; S 10,28. Вычислено,%: С 38,83; Н 6,19; N 13,58; S 10,27. 1. N-Сукцинилгидразид 8-(1,2-диезркси-1-тио-2-ацетамидо- Ь-В-глюкопиранозил)-тиоуксусной кислоты. К раствору 3,1 г (10 ммолей) гидазида 8-карбоксиметил-1,2-дидезоки-1 -тио- 2-ацетамидо- |V- D- глюк оп ира озида (III) в 85 мл охлажденного о О 66% водного метанола прибавлят раствсэр 1,2 г (12 ммолей) янтарого ангидрида в 25 мл хлороформа. Смесь перемешивают 2 ч при 20, Вы павшие кристаллы отфильтровывают,п мывают метанолом и п рекристаллизо вывают из 50% водного метанола. По лученный Ы-сукцинилгидразид S-(l,2 -дидезокси-1-тио-2-ацетамйдо-|Ь-П-глюкопиранозил)-тиоуксусной кисло ты имеет т.пл, 222-224/d/f, - 41 (с 0,1, этанол: вода - 1:1). Выход 3,5 г (85%.). Найдено,%j С 41,20; Н 5,94; N 10,08; S 7,92, , . Вычислено,%: С 41,06; Н 5,67; N 10,26; S 7,82 , . , ft-Пептидилтногликозиды N-ацетил-D-глюкоэамина, синтезированные описанным способом могут быть использованы в биохимическом производстве и лабораторных исследованиях для получения, чисто биоспецифических сорбентов, необходимых для выде,ления и очистки некоторых агглютинирующих белков и Ы-ацетил-р-0 гекс6за минидазы, а также для /кинетического исследования механизма действия этого фермента.

702030 Формула изобретения -ПептиДилтиоглйкозиды-Ы-ацетил-D-глюкозамина общей формулы CHiOH J-oS-R HOSj-/ HNtiOCKj I R - CH CONHCH2,CONHCH2CONHNH2 II R CH CONHCHg CONHCH2CONHCH .CONHNHj III R - CHL CONHNH..j 1У R - CH CONHNHCOCHj CH COOH В качестве лигандов в аффинной хроматографии.. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1, Артюков А,А. Молодцов Н.В, Синтез тиоглико.зидов. Аффинная хроатография .N-ацетил- -О--гексойамини-. зы. ВиоорганиЧеская химия 1, (И) , . 1577 (1975). 2.Jos-fcR.,MifonT.,V/iEclie1 W.,Ttie atsortttiion о proteins to ab-ipttiatic nd aromatic pmines toupE-ed to C anogen i;omicae-activqted ag-qrose Вioctiem BiomS-Acta 362,750974)