Способ очистки биологического материала Советский патент 1980 года по МПК A61K47/00 

Пример 1. Удаление Au антигена из плазмы в результате абсорбции коньюгатом. В ka4ec;TBe матрицы используют сефарозу а в качестве лиганда этилендиамин- октилянтарную кислоту. Получение гель-производного. Активацию сефарозы осуществляют тщательным промыванием 100 мл седиме тированной сефарозы 4В водой. Затем избыток жидкости удаляют фильтрацией на фильтре, работающем под разрежени ем перед тем, как гель переносят в раствор 4 г цианогенбромида в 100 мл дис:тиллированной воды. После .становления равновесия в течение 15 мин при перемешивавший и охлажде ;ии в бане со льдом суспензию геля активируют при рН 11 в течение 6-7 мин. Величину рН поддерживают постоянной добавлением 4 М раствора гидроокиси натрия. , Для со% етания этилендиамина активированный: гель промывают на стеклянном фильтре холодным 0,5 М раство ром натриР бикарбоната-карбоната при рН 9,8, тем как его переносят в раствор 10 г этилендиамина в 100 м дистиллированной воды, рН которой устанавливают равной 9,8 с помощью концентрированной хлористоводородной кислоты. Реакционную смесь оставляют при перем€;1иивании -в течение 20 ч при комнатной температуре. Полученны ,в результате гелевый продукт тщател но промыв;1ют. 25 МП водной суспензии полученно в результс1те вспомогательного геля суспендируют в 20 мл диоксана. По к лям добавляют свежий раствор б г окт лянтарногс) ангидрида в 60 мл диокса при перемешивании, при комнатной те пературе, рН поддерживают 7,5-8 доб лением passбавленного раствора гидроокиси натрия. Адсорбент тщательно промывают диоксаном, смесью диоксана и воды (2:1), водой, 1 М раствором хлористого натрия и буфером, состоящим из 0,05 М трис-буфера, 0,02 М ци грата натрия и 0,10 М хлор того натрия, при рН 7,5. Выход реакции сочетания в расчете на октилянтарную кислоту определяют метолом ЯМР, он составляет 4,8%.. Этилендиамин может быть законен на 1,4-диаминобутан и 1,6-диаминогексан с получением эквивалентных результат(5в. Испытание на антиген. В качестве исходного материала использую: плазму с положительной реакцией на антиген с титром 1:б4 и 1:32. Значения титра приведены относительно стандарного антигена. В каждую из б трубок добавляют 2 антигена-положительной плазмы и 2 м суспензии, состоящей из 3 ч. тщатель седиментированного адсорбента, уравновешенного испытательным буфером. и 1 ч.этого буфера. Образцы двигают в течение 1,2,5,10,20 и 30 мин соответственно и гели отделяют центрифугированием. Исследование верхних слоев на присутствие антигена дает отрицательную реакцию. П р и М е .р 2. Удаление Аиантигена из плазмы в результате сшсорбции коньюгатом се.фароза-(гексаметилендиамин-додецилянтарная кислота) . Получение гель-производного. Для сшивания сефарозы 100 мл геля смешивают с 2 мл эпихлоргидрина и 0,5 г борогидрата натрия. Смесь перемешивают -при в течение .1 ч. Гель тщательно про№лвают теплой водой и смешивают с раствором 0,25 г натрий-борогидрида, растворенного в 50 мл 2 М гидроокиси натрия. Смесь помещают в автоклав при 120С на 1 ч. Затем гель промывают щелочным раствором борогидрата натрия. Медленно добавляют концентрированную уксусную-кислоту до рН 4. Затем гель промывают достаточным объемом воды. Получение вспомогательного геля из сефарозы и гексаметилендиамина проводят по методике примера 1. 25 мл полученного вспомогательного геля переносят на стеклянный фильтр и промывают смесью диоксана и воды (2:1) перед сушкой на фильтре с разрежением и переносом в свежий раствор 1 г/ додецилянтарной кислоты, 1,5 г водного растворимого карбодиимида, N-Циклогексил- N (N-метилморфолиноэтил)-карбодиимид-п-толуил сульфонат-в 60 мл смеси диоксана и воды (2:1). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч перед перенесением на стеклянный фильтр и тщательной промывкой диоксаном, смесью диоксана и воды (2:1), 1М раствором хлористого натрия, водой и испытательным буфером. Выход реакции сочетания в расчете на используемую жирную кислоту по методу ЯМР составляет 2,0%. Испытание на Аи-антиген. Плазму с положительной реакцией на Аи-антиген, имеющую титр 1:128, используют в качестве исходного вещества. Колонку набивают гель-производным, уравновешенным испытательным буфером, 7 МП плазмы с положительной реакцией на Аи-антиген с помощью насоса привод1ят в контакт с гелем (скорость подачи антигена 5 мп/ч). Испытательный буфер добавляют до прекращения элюирования протеинового материала,что устанавливают УФ-скани.рованием,Собранный элюат имеет отрицательную реакцию. С помощью диализа под давлением элюат конц ентрируют в 10 раз и он сохраняет отрицательную реакцию на гепатит.

Пример 3. Удаление АЦ)-антигена из адсорбцией на коньюгат сефароза-каприлгидразид. Получение гель-производного,

Этилкаприлат переносят в соответствующий гидразид с помощью гидразинлиза. 10 мл этилового эфира смегиивают с 10 мл 98%-ного гидразин гидрата. В качестве растворителя добавляют этанол (22 мл) до осветления реакционной смеси, после чего раствор оставляют при комнатной температуре на 15 ч. Закристаллизованный гидразид отфильтровывают и промывают ледяной водой и водным раствором метанола (1:1) при комнатной температуре.

Сефарозу 4В активируют по примеРУ 1.

Гель промывают раствором агента сочетания и сушат в вакууме. Сочетание осуществляют в результате переноса активированного геля в 100 мл насыщенного раствора каприлгидразида, растворенного в диметилформамиде (ДМФ)и 0,2 М бикарбоната натрия (1:1). Значение рН остается неизменным в ходе реакции сочетания, которую осуществляют при перемешивании при комнатной температуре в течение 15 ч. Полученный в результате продукт тщательно прог ывают ДМФ смесью ДМФ и воды (1:1), 1 М хлористым натрием, водой и испытательным буфером.

Выход реакции сочетания в расчете на гидразид по методу ЯМР составляет 2,3%. Испытание на Аи -антиген.

В качестве исходного вещества используют плазму с положительной реакцией на Аи-антиген с титром 1:128. 2 мл суспензии, состоящей из 3 ч. тщательно седиментированного адсор-. бента, уравновешенного испытательным буфером, и 1 ч. этого буфера, добавляют 2 МП Аи-антиген-положительной плазмы. Смесь мягко перемеигивают в течение 30 мин и гель отделяют центрифугированием. Верхний слой имеет отрицательную реакцию наАи-антиген.

Пример 4. Удаление Аи-антигена из раствора альбумина путем адсорбции на коньюгат сефароза-(этилендиамин-октилянтарная кислота). Получение гель-производного.

Гелевый коньюгат получают в соответствии с примером 1. Испытание на Аи-антиген.

Раствор альбумина с положительной реакцией на Аи-антиген с титром 1:64 и полученный в ходе фракционирования антиген положительной плазмы используют в качестве исходного материала. Адсорбцию проводят периодически согласно примеру 3. Верхний слой испытыва(от на антиген, получают отрицательную реакцию.

Пример 5. Удаление Аи-антигена из концентрата с коэффициентом коагуляции в результате адсорбции на коньюгат сефароза-(этилендиамин-октилянтарная кислота). Получение гель-производного.

Гелевый коньюгат получают согласно примеру 1. Испытание на Аи -антиген.

Антиген-положительную плазму

используют для фракционированияКонцентрата, включающего коэффициентьа коагуляции. Готовят 1%-ный протеиновый раствор, который имеет титр антигена 1:32. На стеклянный фильтр со слоем из 5 мл гель-производного, уравновешенного испытуемым буфером,.

добавляют 10 мл протеинового испытательного раствора и гель пр,омывают 3 X 5 мл испытательного буфера. Элюаты исследуют на Аи -антиген, получают отрицательную реакцию.

Пример б. Удаление антигена из плазмы адсорбцией на коньюгат сефароза-тетрадециламин. Получение гель-производного.

Сефарозу активируют в соответствии с примером 1.

Для реакции сочетания 100 мл сефарозы, активированной цианогенбромидом, которую уравновешивают 95%-ным

этанолом и сушат на фильтре под разрежением, добавляют к раствору 22 г тетрадециламина в 100 мл 95%-ного этанола. Смесь оставляют при комнатной температуре при перемешивании на 48 ч. Гель тщательно, промывают

теплым 95%-ным этанолом, водным раствором этанола (1:1), 1М раствором хлористого натрия, водой и испытательным буфером. Выход реакции сочетания по методому ЯМР составляет

4,3%.

Испытание на Аи-антиген,

В качестве исходного, вещества . используют Аи-антигенположитёльную плазму с,титром 1:128. На стеклянный фильтр со слоем из 10 мл гельпроизводного, уравновешенного в испытательном буфере, добавляют 35 мл плазмы. Материал промывают 3 х 10 -мл испытательного буфера и элюаты ис-

следуют на Аи -антиген. Элюаты дают отрицательную реакцию.

Пример 7. Удаление Аи-ан1гиген из плазмы адсорбцией на коньюгат сефароза-2-аминододекан.

55 Получение гель-производного.

2-Додекан превращают в соответствующий амин реакцией с гидроксиламином с получением соответствугомего оксима с последующим каталитическим 60 гидрированием и элиминированием воды. Сефарозу используют в соответствии с примером 1.

Для сочетания 100 мл геля, акти- . вированного цианогенбромидом, промы65 вают 95%-ным этанолом, подвергают сущке на фильтсв под разрежением и дюбавляюг- к рс.ктвору 10 г 2-амиью до декана в, ЮС мл 95%-ногб этанола, Смесь оставляют стоять при пера.мешивании при комнатной температуре S течение ч, после чего гель ттательно про№( тегглым эта НОЛОМ, водным растйором этанола (Itl) Ш растаоррм хлористого нат ,рия, водойи: испытательным буферомо . Выход реакции сочетания по методу ЯМР составляет 1,6%, Испытание на Alj-антнген, . л I .3 качестве искодного материала й пользуют Аи антиген-положнтельную плазму с титром 1:128,Опыт проводят согласно примеру 3 верхний слой дае otpMuaTельную реакцию„ .; Пример 8., Удаление Аи-ан .гена из плаз(Ф1 адсорбцией на коньюг сефароза-(этилендиаминундецен-Ю-кислота),, йолучение гель-пронзаодиогоо , Систему сефароэа-этилендиамин по чают, согласно примеру 1. К свежему раствору 1,85 г ундецилёковой кисло и 2,1 г дициклогексилкарбодиимида, растворенному в 100 мл диоксанау до ляют 100 мл коньгогата сефароза-этн лёндйамин с последующим уравновегииванием диоксином и фильтрацией в аакууме, Гелевуго суспанзий остав.ляго При -перёмегливании на 15 ч при комнатной температуре, пром-тншот дкоксаном, смесью- диоксана и воды (islj Ш раствором хлористого натрия и ис тательным буфером. Выход реакции сочетания в расчет на жирную кислоту по меЮду ЯМР составляет 2,3% Испытание на Аиантиген.. . -В качестве исходного .вещества используют Аи-антиген-положительную плазм с титром , -Опыт проводи согласно примеру 3, Было обнаружено что верхний слой имеет, отрицательну реакцию на антиген. , При мер 9. Удаление Аи-ант гена из плааминогенного концентрата адсорбцией на коньюгат сефароза каприлгидразид. Попучввие гзпь-производного, : Гепевый коньюгат получают соглас примеру 3. .Испытание на Аи-антиген. К 2 мл плааминогенного раствора добавляют Ор5 мл йлаэйм с высоким содержанием антигена, я эта смесь fliaeT положительную реакцию на антигей. Смесь пропускают через колонку аысотбй 4 см, захруженную 10 мл Гель-коньгогата, уравновешенного испытательным буфером. акции соби р:ааотИ испытывают. Было обнаружено ; 1Тб.;элюат, содержаг«кй плаэминогенр дает отрицательнЭю реакцию. ьП р и м е р 10, Удаление Аи-ан тигена, из плаз1«ы адсорбцией на коньюгатполиакриламид-(пропилендецила шн) „ Получение гель-производного. Попиакриламид B-iog eE Р 300 ,остав-., ляют набухать в воде и тщательно проь&гвают 0,05 М раствором натрий фосфатного Суфбера с рН 7. Для дтиэации процесса 20 мл гелевой суспензии в буфере (Of 5. сухого геля/25 мл буфера) смешивают с 5,0 мя глутарового альдегида и инкубируют при . в течение 18ч. Лосле этого гель--. тщательно промывают диоксаном, смесью диоксана и воды (3:2),водой и исПйТательийм буфером. . Испытание на Аи-антиген, Антиген-положительную плазму о титром 1t128 используют в Качестве исходного,вещества -Опыт проводят согласно примеру 3, При испытании верхнез о слоя было обнаружено, что он отрицателен. .. 1 р н м е р 11, Удаление Аи-антигена из плазмы адсорбцией на коньюгат сефароза-(цистеаминоктилянтарная кислота). Полученне гель-производного. Систему сефароэа-цистеамин получают восстановлением сефарозагшстамина, который -получают, согласно примеру 1 в присутствии 0,05 М меркаПтоэтанола в М карбонатном буфере.при рН 8f5 в течение 1 ч, Гель интенсивно прогуивают карбонатным буфером, водой и наконец диоксаном. К растsopy 1,2 г октилянтарной кислоты -3 40 мл диоксана добавляют раствор . 1,84 г днциклогексилкарбодиимида в 10 Мл диоксана и 25 мл сефароза-цистеа на через 2 ч при. перемешивании при комнатной температуре. Через 2 ч гель промывают- диоксаном. Реакционную методику повторяют и затем тщательно промывают Диоксаном,смесью диоксана и воды, водой и 0,1 М .карбоната при рН 8,5. Оставшиеся тиольные группы блокируют в результате обработки геля .60 мг иодоацетаМида в течение 45 мин.Наконец,гель .промывают испытательным бу.ером. Испытание на Аи-антиген,. йнтигей-положит1е1 ьную плазму с титром Is 32 использую1 в качестве исходного материала. Адсорбцию.осуществляют периодически согласно примеру Зо Верхний слой испытывают на антиген и он дает. oтpицaтeJiьнyю . реакцию. Прим ер 12, Удаление А ;-антигена из плазмы адсорбцией на конъюгат сефароза-(reкcaглeтияeндиaминиaфтил-l-yкcycнaя кислота) . Систему сефароза-гексаметилен диамин получают согласно примеру i, 25.мл полученного йспомогательного геля переносят на ГТОКЛРНН « шьгр и прокаавают сглес.ью ли@кс1 Йв и SOItbt (3s2) п-еред суоксй «9рв«4 МмвМ