СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНОГО ПРОТЕИНА Российский патент 1994 года по МПК C07K3/02 C07K3/18 C07K13/00 

Изобретение относится к биологической химии и может быть использовано для выделения плацентарного протеина коровы (ППК-1).

В литературе этот белок не описан и способов его получения к настоящему времени в доступной патентной и медицинской литературе не найдено.

ППК-1 был выявлен в экстрактах ткани раннего хориона коровы (котиледоне) со сроком гестации до 12 недель. При иммунохимическом исследовании методом двойной радиальной иммунодиффузии ППК-1 отсутствовал в плазме быка, сыворотке крови стельной кровы и эмбриональной сыворотке, а также в экстрактах ткани матки, гипофиза, надпочечника, яичка, яичника, почки, печени, селезенки, легкого, сердца. Иммунохимически данный антиген был обнаружен в тканях плаценты (котиледоне и карункуле) на всем протяжении гестации, причем содержание его в ранней плаценте превышало содержание в терминальной в 8-10 раз. На ранних сроках гестации ППК-1 обнаруживался в равных количествах как в материнской, так и в плодной частях плаценты.

Содержание его в этих тканях составило около 4 мг на 100 г ткани ранней плаценты.

Полученные данные позволяют предположить, что ППК-1 является плацента-специфическим антигеном и может быть использован как маркер для ранней диагностики тельности коровы и мониторинга гестации этого животного. Решению этой задачи будет способствовать создание высокочувствительного иммуноферментного метода определения ППК-1 в биологических жидкостях и тканях на основе очищенного препарата этого белка.

Для получения моноспецифических поликлональных антисывороток к ППК-1 ткань раннего хориона коровы (котиледон) гомогенизировали с равным объемом трис-глицинового буфера (0,05 М, рН 8,5), добавляя 0,1% раствор тритона Х-100, троекратно замораживали и оттаивали, центрифугировали, супернатант диализовали 48 ч против 01, М аммоний-бикарбонатного буфера и лиофилизировали. Беспородных кроликов-самцов иммунизировали пятикратно, с интервалом в 3 дня, вводя каждому животному подкожно по 100 мг препарата белков раннего хориона коровы в смеси с полным адъювантом Фрейнда. Реиммунизацию проводили на 30-й день после последней иммунизации, вводя каждому животному по 100 мг препарата белка без адъюванта. Кровь брали на 7-й, 10-й и 13-й дни после реиммунизации. Антисыворотки абсорбировали плазмой быка, экстрактами почки, печени, селезенки. С помощью полученных таким образом антисывороток в ткани ранней плаценты коровы был идентифицирован антиген с подвижностью альфа_о-глобулина в агаровом геле.

Целью изобретения является получение очищенного препарата плацентарного протеина коровы-1, достигаемое следующим образом: плодную часть (котиледон) 10-12-недельной плаценты коровы гомогенизируют с равным количеством 0,05 М трис-глицинового буфера рН 8,5, гомогенат обрабатывают 5-10% -ным раствором бутилового спирта, центрифугируют, супернатант подвергают аффинной хроматографии на иммобилизованном цибакрон-синем красителе, связавшиеся белки элюируют 2,0 М раствором хлорида натрия в смеси с 5% -ным бутиловым спиртом, элюат осаждают при 90% насыщении сульфатом аммония, центрифугируют и осадок фракционируют на колонке с сефадексом G-200 в 0,1 М аммоний-бикарбонатном буфере рН 8,15, фракции, содержащие целевой продукт, собирают и лиофилизируют, получая препарат ППК-1 50% -ной степени чистоты.

Сорбент синтезировали следующим образом. 100 мл сефарозы 6В отмывали на фильтре 1 л дистиллированной воды, слегка отжимали, переносили в химический стакан, заливали 100 мл ацетона, добавляли 1,5 г трихлортриазина, тщательно перемешивали, ставили на магнитную мешалку и при медленном перемешивании добавляли по каплям 10% -ный раствор едкого натра, выжидали 5 мин и прекращали реакцию, добавляя к смеси 50 мл 50% -ного раствора уксусной кислоты.

Полученную проактивированную сефарозу омывали на фильтре от несвязавшегося трихлортриазина и других продуктов реакции 1 л 50% -ного водного раствора ацетона и дополнительно 1 л дистиллированной воды.

Далее сефарозу переносили в химический стакан, добавляли 100 мл дистиллированной воды и 2 г гексаметилендиамина, ставили на магнитную мешалку на ночь при медленном перемешивании. На следующий день полученный продукт отмывали 3 л дистиллированной воды на фильтре, слегка отжимали, перемещали в химическую колбу, добавляли 1 г цибакрон-синего красителя и 1 г карбоната натрия, смесь тщательно перемешивали и помещали в сушильный шкаф при 80^оС на 6 ч. По окончании термической обработки смесь помещали на фильтр и тщательно отмывали 2 л подогретого до 80^оС 2 М раствора хлорида натрия, 2 л дистиллированной воды, еще раз 2 л подогретого до 80^оС 2 М раствора хлорида натрия и 2 л дистиллированной воды, после чего сорбент был готов к употреблению.

Новым в предлагаемом способе является то, что для выделения и очистки из сложной белковой смеси ранее неизвестного белка - плацентарного протеина коровы - 1 использован биоспецифический для данного белка лиганд - цибакрон-синий краситель, иммобилизованный на нерастворимой матрице - сефарозе, причем элюат, содержащий ППК-1 фракционируют на колонке с сефадексом G-200 в летучем буфере, решая тем самым одновременно две задачи: дополнительной очистки и диализа. Кроме того, обработка исходного материала бутиловым спиртом позволяет добиться более полной экстракции белка, частичной денатурации балластных белков и упрощает процедуру первичной обработки ткани плаценты, заменяя обычную в таких случаях троекратную заморозку и оттаивание часовой инкубацией гомогената при 4^оС.

Для достижения цели изобретения выбраны и обоснованы параметрические значения способа. Так, при обработке гомогената плаценты бутиловым спиртом концентрацией менее 5% наблюдалась неполная экстракция белка, при концентрации бутилового спирта более 10% наблюдалась частичная денатурация ППК-1.

Для аффинной хроматографии ППК-1 на иммобилизованном цибакрон-синем красителе оптимальным значением кислотности буфера, при котором сорбция белка была максимальной, оказалось рН 8,0-9,0 и молярность трис-НСl буфера 0,04-0,06; при уменьшении минимального значения рН ниже 8,0 наблюдалось уменьшение количества сорбируемого белка, при увеличении более 9,0 наблюдалась повышенная сорбция балластных белков, что уменьшало чистоту препарата. Изменение молярности трис-НСl буфера более 0,06 приводило к уменьшению сорбции белка на сорбенте и, соответственно к снижению выхода целевого продукта; при молярности трис-НСl буфера менее 0,04 наблюдалась повышенная сорбция балластных белков, что уменьшало чистоту препарата. При элюции связавшихся белков наиболее полная десорбция последних была достигнута при использовании 2,0 М раствора хлорида натрия в смеси с 5% -ным бутиловым спиртом, при этом использование для элюции только 2,0 М раствора хлорида натрия приводило к неполной десорбции белка, аналогичный результат наблюдался при использовании в качестве элюента 4,0 М раствора хлорида натрия.

П р и м е р 1. 100 г ткани 10-12-недельной плаценты коровы (котиледон)гомогенизируют со 100 мл 0,05 М трис-глицинового буфера рН 8,5 и к гомогенату добавляют 5% -ный бутиловый спирт (конечная концентрация). Смесь инкубируют 1 ч при 4^оС, центрифугируют, супернатант диализуют 24 ч против дистиллированной воды при 4^оС и 24 ч против 0,04 М трис-НСl буфера рН 8,0. Диализат повторно центрифугируют и используют в аффинной хроматографии на колонке, уравновешенной тем жем буфером и заполненной сефарозой с имобилизованным цибакрон-синим красителем. После отмывки сорбента от несвязавшихся белков проводят элюцию 2,0 М раствором хлорида натрия в смеси с 5% -ным бутиловым спиртом. Элюат осаждают при 90% насыщении сульфатом аммония в течение 12 ч при 4^оС, центрифугируют 45 мин со скоростью 8000 об/мин, осадок растворяют в минимальном объеме дистиллированной воды и фракционируют в колонке с сефадексом G-200, уравновешенном 0,1 М аммоний-бикарбонатным летучим буфером рН 8,15, фракции, содержащие ППК-1 собирают и лиофилизируют, получая 0,7 мг белка. Содержание ППК-1 40% , выход 7% .

П р и м е р 2. Ткань плаценты обрабатывают как в примере 1. Аффинную хроматографию проводят в 0,06 М трис-НСl буфере рН 9,0. Элюцию и дальнейшие процедуры осуществляют как в примере 1. Получают 1,0 мг белка с содержанием ППК-1 35% . Выход 8,75% .

П р и м е р 3. Ткань плаценты обрабатывают как в примере 1. Аффинную хроматографию проводят в 0,05 М трис-НСl буфере, рН 8,5. Элюцию и дальнейшие процедуры как в примере 1. Получают 0,8 мг белка, содержание ППК-1 50% , выход 10% .

Предлагаемый способ является оригинальным способом выделения нового белка - плацентарного протеина коровы-1.

При изучении физико-химических свойств ППК-1 установлено, что данный белок обладает электрофоретической подвижностью (относительно альбумина) - 1,0, молекулярной массой в гель-фильтрации около 110 кД. Белок содержит углеводы при окрашивании дуги преципитации по методу Шиффа и осаждается сульфатом аммония при 65% насыщения.

Данные иммунохимического анализа, а также физико-химические свойства ППК-1 позволяют предположить, что этот белок неидентичен альфа-фетопротеину коровы, имеющему мол. м. около 70 кД и встречающемуся в больших количествах в эмбриональной сыворотке; фетуину эмбриональной сыворотки; трофобластическому протеину коровы, имеющему мол. м. 22-24 кД; коровьему высокомолекулярному гликопротеину с молекулярной массой около 700 кД; протеину В, имеющему мол. м. 47-53 кД; сывороточному гликопротеину, ассоциированному с ранней беременностью, имеющему молекулярную массу 70 кД и найденному в сыворотке стельных коров.

Поскольку в настоящее время нет надежного диагностического теста для раннего определения стельности у коров, разработка оригинального способа выделения ППК-1 и получение к нему антисыворотки представляется актуальной научной задачей, так как данный белок выявлен в ткани ранней плаценты и разработка высокочувствительного иммуноферментного метода определения ППК-1 в сыворотке крови стельных коров на основе очищенного препарата данного белка позволит получить диагностический тест для ранней диагностики гестации и ее мониторинга. Кроме того, способ получения очищенного препарата ППК-1 позволит получить очищенный плацентарный протеин коровы-1 для выяснения биологических свойств данного белка с целью последующего использования его как ветеринарного препарата. (56) ЕР N 0206181, кл. С 07 К 13/00, С 12 N 15/006, 1987.

Использование: биологическая химия, выделение плацентарного протеина коровы. Сущность применения: проводят фракционирование бутанольного экстракта белков раннего хориона коровы на иммобилизованном цибакронсинем красителе с последующей гель-фильтрацией элюата на сафадексе G-200.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНОГО ПРОТЕИНА, включающий гомогенизацию ткани, обработку спиртом, центрифугирование, диализ супернатанта, повторное центрифугирование и хроматографирование с последующим элюированием, отличающийся тем, что гомогенизируют ткань ранней плаценты коровы, обработку проводят 5 - 10% -ным бутиловым спиртом, диализ осуществляют против 0,04 - 0,06 М трис-HCI-буфера рН 8,0 - 9,0, из хроматографий используют аффинную хроматографию на сефарозе с иммобилизованным цибакрон-синим красителем, элюирование проводят 2,0 М раствором хлорида натрия в смеси с 5% -ным бутиловым спиртом, дополнительно элюат осаждают при 90% -ном насыщении сульфатом аммония, центрифугируют и осадок подвергают фракционированию на сефадексе G = 200 в 0,1 М аммоний-бикарбонатном буфере рН 8,5, фракции, содержащие целевой продукт, собирают и лиофилизируют.