СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНОГО ПРОТЕИНА Российский патент 1994 года по МПК C07K3/02 C07K3/18 C07K13/00 

Изобретение относится к биологической химии и может быть использовано для выделения плацентарного протеина овцы (ППО-1).

В литературе этот белок не описан и способов его получения к настоящему времени в доступной патентной и медицинской литературе не найдено.

ППО-1 был выявлен в экстрактах ткани раннего хориона овцы (котиледоне) со сроком гестации до 10 недель. При сравнительном иммунодиффузионном анализе с различными биологическими жидкостями и экстрактами тканей данный белок отсутствовал в плазме крови барана, суягной овцы и эмбриональной сыворотке; в экстрактах ткани матки, гипофиза, надпочечника, яичка, яичника, в экстрактах тканей висцеральных органов. Иммунохимически данный антиген был обнаружен в тканях плаценты (котиледоне и карункуле) на всем протяжении гестации, причем содержание его в ранней плаценте превышало таковое в терминальной в 50 раз. ППО-1 обнаруживался в равных количествах как в материнской (карункуле), так и в плодной (котиледоне) частях плаценты. Содержание его в этих тканях составило около 10 мг на 100 г ткани ранней плаценты.

Полученные данные позволяют предположить, что ППО-1 является плацента - специфическим антигеном и может служить перспективно ценным маркером для ранней диагностики суягности овцы и мониторинга гестации этого животного. Эту задачу позволит решить эффективный способ очистки ППО-1 и создание на основе полученных препаратов белка высокочувствительного иммуноферментного метода его определения в биологических жидкостях и тканях.

Для получения моноспецифических поликлональных антисывороток к ППО-1 ткань раннего хориона овцы (котиледон) гомогенизировали с равным объемом трис-глицинового буфера (0,05 М, рН 8,5), добавляя 0,1% -ный раствор детергента тритон Х-100, троекратно замораживали и оттаивали, центрифугировали, супернатант диализовали 48 ч против 0,1 М аммоний-бикарбонатного буфера и лиофилизировали. Кроликов иммунизировали пятикратно, вводя каждому животному по 100 мг препарата белков раннего хориона овцы подкожно, в связи с полным адъювантом Фрейнда с интервалом в 3 дня. Реиммунизацию проводили на 30-й день после последней иммунизации, вводя каждому животному по 100 мг препарата белка без адъюванта. Кровь брали на 7-й, 10-й и 13-й день после реиммунизации. Полученные антисыворотки абсорбировали плазмой барана, экстрактами почки, печени и селезенки. С помощью полученных таким образом антисывороток в ткани ранней плаценты овцы был идентифицирован антиген с подвижностью альфа_о-глобулина в агаровом геле.

Целью изобретения является получение очищенного препарата плацентарного протеина овцы -1, достигаемое следующим образом: плодную часть (котиледон) 10-12 недельной плаценты овцы гомогенизируют с равным количеством 0,05 М трис-глицинового буфера, рН 8,5, гомогенат обрабатывают 5-10% -ным раствором бутилового спирта, центрифугируют, супернатант диализуют против 0,02-0,05 М трис-НСl буфера, рН 7,5-8,5, повторно центрифугируют и подвергают аффинной хроматографии на иммобилизованном протаминсульфате, связавшиеся белки элюируют 2,0-4,0 М раствором хлорида натрия, элюат осаждают при 80% насыщения сульфатом аммония, центрифугируют, осадок фракционируют на колонке с сефадексом G-200 в 0,1 М аммоний-бикарбонатном буфере, рН 8,15, фракции, содержащие целевой продукт, собирают и лиофилизируют, получая препарат плацентарного протеина овцы -1 50% -ной степени чистоты.

Сорбент синтезировали следующим образом. 100 мл сефарозы 6В отмывали на фильтре 1 л дистиллированной воды, слегка отжимали, переносили в химический стакан и заливали 100 мл ацетона, далее добавляли 1,5 г трихлортриазина, тщательно перемешивали, ставили на магнитную мешалку и при медленном перемешивании добавляли по каплям 10% -ный раствор едкого натра, доводя рН до 8,5. После достижения рН 8,5 прекращали добавление едкого натра, выжидали 5 мин и добавляли 50 мл 50% -ного водного раствора уксусной кислоты, тем самым останавливая реакцию. Полученную проактивированную сефарозу отмывали на фильтре от несвязавшегося трихлортриазина 1 л 50% -ного водного раствора ацетона и 1 л дистиллированной воды, далее переносили в химический стакан, добавляли 100 мл дистиллированной воды, 1 л протамина-сульфата и 2 г бикарбоната натрия, ставили на магнитную мешалку и осталяли на ночь при медленном перемешивании. На следующий день полученную протамин-сефарозу отмывали 3 л дистилированной воды и 1 л 0,9% раствора хлорида натрия, после чего сорбент был готов к упортреблению.

Новым в предлагаемом способе является то, что для выделения и очистки из сложной белковой смеси ранее неизвестного белка - плацентарного протеина овцы использован биоспецифический для данного белка лиганд - протаминсульфат, иммобилизованный на нерастворимой матрице - сефарозе, причем элюат, содержащий ППО-1, фракционируют на колонке с сефадексом G-200 в летучем буфере, решая тем самым одновременно две задачи: дополнительной очистки и диализа. Кроме того, обработка исходного материала бутиловым спиртом позволяет добиться более полной экстракции белка, частичной денатурации балластных белков и упрощает процедуру первичной обработки ткани плаценты, заменяя обычную в таких случаях троекратную заморозку и оттаивание часовой инкубацией гомогената при 4^оС.

Для достижения цели изобретения выбраны и обоснованы параметрические значения способа. Так, при обработке гомогената плаценты бутиловым спиртом концентрацией менее 5% наблюдалась неполная экстракция белка, при концентрации последнего более 10% наблюдалась частичная денатурация ППО-1.

Для аффинной хроматографии ППО-1 на иммобилизованном протаминсульфате оптимальным значением кислотности буфера для наилучшей сорбции белка оказалось рН диапазоне 8,5-7,5 и молярность трис-НСl буфера 0,02-0,05; при уменьшении минимального значения рН ниже 7,5 наблюдалось уменьшение количества сорбируемого белка, при увеличении рН более максимального значения рН 8,5 количество сорбируемого белка отвечало оптимальному значению, однако при этом увеличивалась сорбция балластных белков, что уменьшало чистоту препарата. Изменение молярности трис-НСl буфера более 0,05 приводило к уменьшению сорбции белка на сорбенте и соответственно к снижению выхода целевого продукта; при рН менее 0,02 М наблюдалось частичное выпадение белка в осадок, что также снижало выход целевого продукта. При элюции связавшихся белков оптимальным значением элюирующего буфера была молярность его 2,0-4,0, при использовании растворов меньшей молярности наблюдалась неполная десорбция связавшихся белков; увеличение молярности более 2,0 не оказывало существенного значения на результаты эксперимента.

П р и м е р 1. 100 г ткани 10-12-недельной плаценты овцы (котиледон) гомогенизируют со 100 мл 0,05 М трис-глицинового буфера рН 8,5 и к гомогенату добавляют 5% -ный бутиловый спирт (конечная концентрация). Смесь инкубируют 1-2 ч при 4^оС, центрифугируют и супернатант диализуют 24 ч против дистиллированной воды при 4^оС и 24 ч против 0,02 М трис-НСl буфера, рН 7,5. Диализат повторно центрифугируют и используют в аффинной хроматографии на колонке, уравновешенной тем же буфером и заполненной сефарозой с иммобилизованным протаминсульфатом. После отмывки сорбента от несвязавшихся белков проводят элюцию 2,0 М раствором хлорида натрия. Элюат осаждают при 80% насыщении сульфатом аммония в течение 12 ч при 4^оС, центрифугируют, осадок растворяют в минимальном объеме дистиллированной воды и фракционируют в колонке с сефадексом G-200, уравновешенным 0,1 М аммоний-бикарбонатным летучим буфером, рН 8,15. Фракции, содержащие ППО-1, собирают и лиофилизируют, получая 1,5 мг белка. Содержание ППО-1 50% , выход 7,5% .

П р и м е р 2. Ткань плаценты обрабатывают как в примере 1. Аффинную хроматографию проводят в 0,05 М трис-НСl буфере при рН 8,5. Элюцию проводят 4,0 М хлоридом натрия. Дальнейшие процедуры как в примере 1. Получают 2,2 мг белка, содержание ППО-1 40, выход 8,8% .

П р и м е р 3. Ткань плаценты обрабатывают как в примере 1. Аффинную хроматографию проводят в 0,025 М трис-НСl буфере при рН 8,0. Элюцию и дальнейшие процедуры осуществляют как в примере 1. Получают 2 мг белка, содержание ППО-1 50% , выход 10% .

Предлагаемый способ является оригинальным способом выделения нового плацентарного белка - плацентарного протеина овцы-1.

При изучении физико-химических свойств ППО-1 установлено, что данный белок обладает электрофоретической подвижностью (относительно альбумина) - 0,95, молекулярной массой, определенной в гель-фильтрации - около 100 кД. Белок содержит углеводы при окрашивании дуги преципитации по методу Шиффа и осаждается сульфатом аммония при 60% насыщения.

Данные иммунохимического анализа, а также физико-химические свойства ППО-1 позволяют поедположить, что этот белок неидентичен альфа-фетопротеину овцы, имеющему молекулярную массу около 70 кД и встречающемуся в больших количествах в эмбриональной сыворотке; плацентарному лактогену овцы, имеющему молекулярную массу около 20 кД и электрофоретическую подвижность альфа₂-глобулина; овечьему трофобластическому протеину, имеющему молекулярную массу 19 кД, и высокомолекулярному гликопротеину овцы, имеющему молекулярную массу 765 кД.

Разработка оригинального способа выделения ППО-1 и получение к нему антисыворотки является актуальной научной задачей, поскольку данный белок выявлен в ткани ранней плаценты и разработка высокочувствительного иммуноферментного метода определения ППО-1 в сыворотке крови суягных овец на основе очищенного препарата данного белка позволит получить диагностический тест для ранней диагностики гестации и ее мониторинга.

Использование: сельскохозяйственная биотехнология, экспериментальная ветеринария. Сущность применения: проводят фракционирование бутанольного экстракта белков раннего хориона овцы на иммобилизованном протаминсульфате с последующей гель-фильрацией элюата на сефадексе G-200.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНОГО ПРОТЕИНА, включающий получение гомогената ткани, центрифугирование, диализ супернатанта, повторное центрифугирование и хроматографирование, отличающийся тем, что из тканей используют ткань плаценты овцы, гомогенат перед центрифугированием обрабатывают 5 - 10% -ным бутиловым спиртом, диализ осуществляют против 0,02 - 0,05 М трис-HCI-буфера рН 7,5 - 8,5, а из хроматографий используют аффинную хроматографию на сефарозе с иммобилизованным протаминсульфатом, после хроматографирования дополнительно проводят осаждение элюата при 80% -ном насыщении сульфатом аммония, центрифугируют и осадок подвергают фракционированию на сефадексе G-200 в 0,01 М аммоний-бикарбонатном буфере, а фракции, содержащие целевой продукт, собирают и лиофилизируют.