СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНОГО ПРОТЕИНА Российский патент 1994 года по МПК C07K3/02 C07K3/18 C07K13/00 

Изобретение относится к биологической химии и может быть использовано для выделения плацентарного протеина коровы -2(ППК-2).

Этот белок не описан и способов его получения к настоящему времени в доступной патентной и медицинской литературе не найдено.

ППК-2 был выявлен в экстрактах ткани раннего хориона коровы (котиледоне) со сроком гестации до 12 недель. При иммунохимическом исследовании методом двойной радиальной иммунодиффузии ППК-2 отсутствовал в плазме быка, сыворотке крови стельной коровы и эмбриональной сыворотке, а также в экстрактах ткани матки, гипофиза, надпочечника, яичка, яичника, почки, печени, селезенки, легкого, сердца. Иммунохимически данный антиген был обнаружен в тканях плаценты (котиледоне и карункуле) на всем протяжении гестации, причем содержание его в ранней плаценте превышало содержание в терминальной плаценте в 3-4 раза. На ранних сроках гестации ППК-2 обнаруживался в равных количествах как в материнской, так и в плодной частях плаценты. Содержание его в этих тканях составило 0,2 мг на 100 г ткани ранней плаценты.

Полученные данные позволяют предположить, что ППК-2 является плацента-специфическим антигеном и может быть использован как маркер для ранней диагностики стельности коровы и мониторинга гестации этого животного. Создание высокочувствительного иммуноферментного метода определения ППК-2 в биологических жидкостях на основе очищенного препарата этого белка будет способствовать решению этой задачи.

Для получения моноспецифических поликлональных антисывороток к ППК-2 ткань раннего хориона коровы (котиледон) гомогенизировали с равным объемом 0,05 М трис-глицинового буфера рН 8,5, добавляя 0,1% -ный раствор тритона Х-100, троекратно замораживали и оттаивали, центрифугировали, супернатант диализовали 48 ч против 0,1 М аммоний-бикарбонатного буфера и лиофилизировали. Беспородных кроликов-самцов иммунизировали пятикратно, с интервалом в 3 дня, вводя каждому животному подкожно по 100 мг препарата белков раннего хориона коровы в смеси с полным адьювантом Фрейнда. Реиммунизацию проводили на 30-й и 90-й дни после последней иммунизации, вводя каждому животному по 100 кг препарат белка без адьюванта. Антисыворотки к ППК-2 удовлетворительного качества были получены после второй реиммунизации. Кровь брали из краевой вены уха на 7-й, 10-й и 13-й дни после реиммунизации. Полученные антисыворотки абсорбировали плазмой быка, экстрактами почки, печени, селезенки. С помощью полученных таким образом антисывороток в ткани ранней плаценты коровы был идентифицирован антиген с подвижностью альфа-глобулина в агаровом геле.

Целью изобретения является получение очищенного препарата плацентарного протеина коровы-2, достигаемое следующим образом: плодную часть (котиледон) 10-12 недельной плаценты коровы гомогенизируют с равным количеством (вес/объем) 0,01 М трис-НСl буфера рН 8,5, троекратно замораживают и оттаивают, гомогенат центрифугируют и супернатант подвергают (без диализа) аффинной хроматографии на иммобилизованном гексаметилендиамине, связавшиеся белки элюируют 2,0-4,0 М раствором хлорида натрия с добавлением 1% раствора глицина, элюат осаждают при 90% насыщении сульфатом аммония, центрифугируют и осадок фракционируют на колонке с сефадексом G= 200 в 0,1 М аммоний-бикарбонатном буфере рН 8,15, фракции, содержащие целевой продукт, собирают и лиофилизируют, получая препарат ППК-2 50% -ной степени чистоты.

Сорбент синтезировали следующим образом. 100 мл сефарозы 6В отмывали на фильтре 1 л дистиллированной воды, слегка отжимали, переносили в химический стакан, заливали 100 мл ацетона, добавляли 1,5 г трихлортриазина, тщательно перемешивали, ставили на магнитную мешалку и при медленном перемешивании добавляли по каплям 10% раствор едкого натра, доводя рН до 8,5, после чего прекращали добавление едкого натра, выжидали 5 мин и прекращали реакцию, добавляя к смеси 50 мл 50% -ной уксусной кислоты. Полученную проактивированную сефарозу отмывали на фильтре от несвязавшегося трихлортриазина и продуктов реакции 1 л 50% -ного водного раствора ацетона и дополнительно 1 л дистиллированной воды; далее сефарозу переносили в химический стакан, добавляли 100 мл дистиллированной воды и 2 г гексаметилендиамина, ставили на магнитную мешалку на ночь при медленном перемешивании. На следующий день полученный сорбент отмывали 3 л дистиллированной воды на фильтре, после чего сорбент гексаметилендиаминсефароза был готов к употреблению.

Новым в предлагаемом способе является то, что для выделения и очистки из сложной белковой смеси ранее неизвестного белка - плацентарного протеина коровы-2 использован биоспецифический для данного белка лиганд - гексаметилендиамин, иммобилизованный на нерастворимой матрице - сефарозе, причем элюат, содержащий ППК-2, фракционируют на колонке с сефадексом G-200 в летучем буфере, решая тем самым одновременно две задачи: дополнительной очистки и диализа. Кроме того, обработка исходного материала буферным раствором с низкой ионной силой позволяет избежать диализа гомогената и дает возможность использовать супернатант сразу в аффинной хроматографии.

Для достижения цели изобретения выбраны и обоснованы параметрические значения способа. Так, при обработке исходного материала (котиледон) буфером с более низкой, чем 0,01 М ионной силой наблюдалась неполная экстракция белка, при обработке же буфером с ионной силой более 0,01 суммарная ионная сила гомогената превышала 0,08, что приводило к снижению сорбции ППК-2 на сорбенте.

Для аффинной хроматографии на иммобилизованном гексаметилендиамине оптимальным значением рН, при котором наблюдалась максимальная сорбция, было рН 8,4-7,4 и молярность трис-НСl буфера 0,04-0,08; при уменьшении минимального значения рН ниже 7,4 наблюдалось уменьшение количества сорбируемого белка, при увеличении более 8,4 отмечалась повышенная сорбция балластных белков, что приводило к уменьшению чистоты препарата. Изменение молярности трис-НСl буфера более 0,08 приводило к уменьшению сорбции белка на сорбенте и соответственно к снижению выхода целевого продукта; при молярности трис-НСl буфера менее 0,04 наблюдалась повышенная сорбция балластных белков, что уменьшало чистоту препарата. При элюции связавшихся белков наиболее полная десорбция их была достигнута при использовании 2,0-4, М раствора хлорида натрия с добавлением 1% глицина, причем без добавления глицина в элюат десорбировалось только 80% связавшихся с сорбентом белков.

П р и м е р 1. 100 г ткани 10-12-недельной плаценты коровы (котиледон) гомогенизируют со 100 мл 0,01 М трис-НСl буфера рН 8,5, троекратно замораживают и оттаивают, центрифугируют при 6000 об/мин 45 мин, супернатант подвергают аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным гексаметилендиамином, уравновешенной 0,04 М трис НСl буфером рН 7,4. Несвязавшиеся белки отмывают тем же буфером и проводят элюцию 2,0 М хлоридом натрия в смеси с 1% глицином. Элюат осаждают при 90% насыщении сульфатом аммония в течение 12 ч при 4^оС, центрифугируют при 8000 об/мин 45 мин, осадок растворяют в минимальном объеме дистиллированной воды и фракционируют в колонке с сефадексом G-200, уравновешенной 0,1 М аммоний-бикарбонатным летучим буфером рН 8,15, фракции, содержащие ППК-2, собирают и лиофилизируют, получая 0,04 мг белка. Содержание ППК-2 40% , выход 8% .

П р и м е р 2. Ткань плаценты обрабатывают как в примере 1. Аффинную хроматографию проводят 0,08 М трис-НСl буфере рН 8,4. Связавшиеся белки элюируют 4,0 М хлоридом натрия в смеси с 1% глицином. Остальные процедуры как в примере 1. Получают 0,055 мг белка. Содержание ППК-2 40% , выход 10% .

П р и м е р 3. Ткань плаценты обрабатывают как в примере 1. Аффинную хроматографию проводят в 0,06 М трис-НСl буфере рН 7,9. Связавшиеся белки элюируют 3,0 М хлоридом натрия в смеси 1% глицином. Остальные процедуры как в примере 1. Получают 0,6 мг белка. Содержание ППК-2 50% , выход 15% .

Предлагаемый способ является оригинальным способом выделения нового белка - плацентарного протеина коровы-2.

При изучении физико-химических свойств ППК-2 было установлено, что данный белок обладает электрофоретической подвижностью (относительно альбумина) - 1,0, молекулярной массой, определенной методом гель-фильтрации около 70 кД. Белок не содержит углеводов при окрашивании дуги преципитации по методу Шиффа и осаждается сульфатом аммония при 30-75% насыщения.

Данные иммунохимического анализа, а также физико-химические свойства ППК-2 позволяют считать, что этот белок неидентичен альфафетопротеину коровы, имеющему молекулярную массу около 70 кД, но встречающемуся в больших количествах в эмбриональной сыворотке; фетуину, также встречающемуся в эмбриональной сыворотке; трофобластическому протеину головы, имеющему мол. м. 22-24 кД; коровьему высокомолекулярному гликопротеину с мол. м. около 700 кД; протеину В, имеющему мол. м. 47-53 кД; сывороточному гликопротеину, ассоциированному с ранней беременностью, найденному в отличие от ППК-2 в сыворотке стельных коров.

Разработка оригинального способа выделения ППК-2 и получение к нему антисыворотки является актуальной научной задачей, так как данный белок выявлен в ткани ранней плаценты и создание высокочувствительного иммуноферментного метода определения ППК-2 в сыворотке крови стельных коров на основе очищенного препарата данного белка позволит получить диагностический тест для ранней диагностики гестации и ее мониторинга. (56) ЕРN= 206181, кл. С 07 К 13/00, 1987.

Использование: сельскохозяйственная биотехнология, экспериментальная ветеринария. Сущность применения: проводят фракционирование супернатанта гомогената белков раннего хориона коровы на иммобилизованном гексаметилендиамине с последующей гель-фильтрацией элюата на сефадексе G-200.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНОГО ПРОТЕИНА, включающий получение гомогената, центрифугирование, хроматографирование супернатанта, элюирование, отличающийся тем, что из хроматографий используют аффинную хроматографию на сефарозе с иммобилизованным гексаметилендиамином, элюирование проводят 2,0 - 4,0 М раствором хлорида натрия в смеси с 1% -ным глицином, дополнительно элюат осаждают при 90% -ном насыщении сульфатом аммония, центрифугируют и осадок фракционируют на сефадексе G = 200 в 0,1 М аммоний бикарбонатном буфере, фракции, содержащие целевой продукт, собирают и диализуют.