Макромолекулярное производноеТРипСиНА B КАчЕСТВЕ фЕРМЕНТА пРОТЕ-ОлиТичЕСКОгО дЕйСТВия и СпОСОб ЕгОпОлучЕНия Советский патент 1981 года по МПК C08F226/10 

Q-2°C, полимер вьаделяют гель-хроматографически в том же растворе.

Синтез высокомолекулярного ин-ициатора, физиологически активного соединения, содержащего реакционноспособную аэосвязь, на основе трипсина.

Пример 1. Модификацию трипсина проводили при +2С в 0,1 М бикарбонатном буфере при рН 8,5. К 100 мл 0,1%-ного раствора трипсина (0,04210 моля) в бикарбонатном буфере добавляли 0,13 г (8,4 ) дихлоргидрата бис-метилимидата азоизомасляной кислотыпорциями в течение 50 мин. рН раствора поддерживали добавлением 5 М NaOH, раствор постоянно быстро перемешивался, чтобы предотвратить локальную инактивацию фермента. Затем раствор подкисляли концентрированной соляной кислотой до рН 3,3, после чего реакционную массу гель-хроматографировал |на колонке (4i405 -см) с сефадексом Г-50, элюент - водный раствор соляной кислоты р рН 3,5, скорость элю ирования 20 мл/ч, спектрофотометричекая идентификация при 280 нм. На данной колонке объем выхода высокомолекулярного инициатора - 900 мл, нативного трипсина - 800 мл. Нужную фракцию лиофилизовали, выход высокомолекулярного инициатора 54%.

Протеолитическую активность определяли по методу Кунитда, субстрат 1%-ный раствор казеина в 0,1 М раствора На/гНРОц., рН 7,8. Сохранялась 100%-ная активность высокомолекулярного инициатора по сравнению с нативным трипсином.

Число свободных N Н групп в высокомолекулярном инициаторе было определено с помощью 2 ,4 , б-.тринитробензолсульфокислоты, п 3.

Графтирование трипсина поливинИлпирролидоном.

Пример 2. 0,015 г (0,6 моля) высокомолекулярного инициатора, 0,17 мл (1500 10 моля) Н-вини 1Пирролидона и 0,13 мл водного раствора соляной кислоты такой концентрации, чтобы рН смеси было .равно 3,2, полимеризовали 2 ч при 40С в ампуле, запаянной под аргоном.

Затем ампула выдерживалась 60 мин при 0°С, после чего содержимое разбавляли раствором соляной кислоты с рН 3,5 до 2 мл и гель-хроматографировали на колонке (4 х-105 см) с сефадексом Г-50, элюент водный раствор соляной кислоты .с рН 3,5, скорость элюирования 22 мл/ч., спектрофотометрическая идентификация при 280 нм. Объем выхода трипсина, иммобилизованного на поли-М-винилпирролидоне, 485 мл.

Молекулярная масса, определенная с помощью гель-хроматографии, составляла 275000..Молекулярная масса, рассчитанная из данных, полученных по

методу Лоури-Фолина, составляла 27300 Наблюдалась хорошая сходимость между результатами, полученными разными методами. Молекулярная масса нативного трипсина 23800, таким образом, одна цепь иммобилизую1чего поли-М-винилпирролидона имела молекулярную массу в среднем 1200.

Протеолитическая активность иммобилизованного трипсина, определенная по казеину, равнялась 20% по отношению к нативному трипсину.

Пример 3. О,03 г (1,2- 10 моля) высокомолекулярного инициатора, о, 34 мл (3000-10 моля) N-винилпирЕЮЛидона и 0,26 мл водного раствора соляной кислоты такой концентрации, чтобы рН смеси было равно 3,7, полимеризовали 2 ч при 60°С в ампуле, запаянной под аргоном. Затем ампула выдерживалась 45 мин при +2с, после чего содержимое разбавляли раствором соляной кислоты с ,3 до 2 мл и гель-хроматографировали на колонке (4 105 см) сефадексом Г-50, элюент - водный раствор соляной кислоты с рН 3,3, скорость элюирования 23 мл/ч, спектрофотометрическая идентификация при 280 нм.

Объем выхода графтированного трипсина - 735 мл.

Молекулярная масса, определенная с помощью метода Лоури-Фолина, составляла 25600, т.е. одна цепь иммобилизующего поли-N-винилпирролидона имела молекулярную массу в среднем 600.

Протеолит.ическая активность иммобилизованного трипсина, определенная по казеину, равнялась 15% по отношению к нативному трипсину.

Пример 4. 0,3 г (1,2 моля) высокомолекулярного инициатора, 0,34 мл (300010 моля) N-винилпирролидона и 0,26 мл водного раствора соляной кислоты такой концентрации, чтобы рН смеси было равно 3,5, полимеризовали 1,5 ч при в ампуле, запаянной под аргоном.

Затем ампула выдерживалась 60 мин при ОС, после чего содержимое разбаляли раствором соляной кислоты с рН 3,7 до 2 мл и гель - хроматографировали на колонке (4 105 см) с сефадексом Г-50, элюент - водный раствор .соляной кислоты с рН 3,7, скорость элюирования 25 мл/ч, спектрофотометрическая идентификация при 280 нм.

Объем выхода графтированного трипсина - 825 мл.

Молекулярная масса, определенная помощью гель-хроматографии, составляла 24500. Молекулярная масса, рассчитанная из данных, полученных по методу Лоури-Фолина, составляла 24300. Наблюдалась хорошая сходимость результатов, полученных разными методами. Одна цепь иммобилизующего поли-N-винилпирролидона имела молекулярную массу в среднем 200.

Протеолитическая активность иммобилизованного трипсина, определенная по казеину, равнялась 54% по сравнению с нативным трипсином.

Изменение условий полимеризации (время, температура, рН) позволяет варьировать молекулярную массу иммоби лизующего полимера, поли-М-винилпирро лидона от 600 до 3600,

Трипсин, графтированный пoли N-винилпирролидоном различной молекулярной массы, сохраняет протеолитическую активность от 15 до 54% по сравнению с нативным трипсином, приобретая при этом повышенную устойчивость к протеолитической деградации и тепловой денатурации. Показано, что в условиях протеолитической деграда ции в течение 4 ч происходила потеря активности коньюгатов на 60-65% по сравнению с 85% в случае нативного трипсина.

Увеличение протеолитической активности во времени в условиях тепловой денатурации можно объяснить тем, что при данной температуре появляется больше степеней свободы для изменения конформации молекулы графти рованного трипсина и последняя принимает конфоргугацию, соответствующую максимальной активности при данной температуре.

Таким образом, графтирование трипсина позволяет улучшить его ферментативные свойства.

Формула изобретения

1.Макромолекулярное производное трипсина общей формулы

СН5

.с-в)з, щ енз

где Т - трипсин, модифицированный по Е-аминогруппам лизина, R - поли-М-винилпирролидон с М.в. (27,5-24,5)10 в качестве фермента протеолитического действия

2.Способ получения макромолекулярного производного трипсина по п. отличающийся тем, что проводят полимеризацию N-винилпирролидона в водном растворе в присутствии инициатора общей формулы

ЙНз (Нз

Т-{-Е (1- -1{ И-С-В)з

}JH2 Нз 1Нз

R - амидная или сложноэфирная группировка и процесс ведут 1,5-2 ч при 40-60°С в разбавленной соляной кислоте при рН 3,2-3,7 в атмосфере аргона, затем смесь охлаждают при 0-2 С в течение 45-60 мин и производят гель-хроматографическое выделение продукта в том же растворе.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР № 545648, кл. А 61 К 31/79, 1975 (прототип).