Способ получения иммобилизованных ферментов Советский патент 1979 года по МПК C07G7/02 

1

Данное изобретение относится к способу нолучения иммобилизованных ферментов, которые находят широкое применение в тонком органическом синтезе, медицине, пищевой промышленности.

В литературе описаны различные способы мобилизации ферментов на носителях. Известны способы иммобилизации путем адсорбции фермента на носителях с высокоразвитой поверхностью, а также путем включения фермента в различные гелевые структуры .

Недостатком таких способов является малая прочность связи фермента с носителем, в результате чего фермент в процессе эксплуатации может диффундировать с носителя в раствор.

Известны также способы иммобилизации, заключающиеся в ковалентном связывании фермента с предварительно активированным носителем. Активация носителя необходима для создания на нем функциональных групп, способных взаимодействовать с молекулами фермента. Наиболее распространенным способом активации носителя является обработка носителя циангалогепидами в щелочной среде 1. Недостаток этого способа активации заключается в том, что оп применим только для актнвации носителей, содержаниьх оксигрушП), а

2

используемое для активации соединение является отравляюшим веществом.

В носледние годы развивается способ иммобилизации путем привитой сополимеризации полимерного носителя с мономером под действием ионизирующего излучения с последующей обработкой полученного при этом привитого сополимера активатором и раствором фермента 2. Так, на

полипропилен под действием 7излучения Со прививают л-нитростирол. Гомоиолимер л-нитростирола отделяют от привитого сополимера экстракцией смесью хлороформа и бензола в течение 48 ч. Нривитой сополимер затем обрабатывают в течение 24ч метанолом для удаления бензола и сушат в вакууме. Нитрогруппы полученного привитого сополимера восстанавливают в аминогруппы диспергированием сополимера в

диметилформамиде и обработкой хлоридом олова и соляной кислотой ири 100°С в течение 18 ч. Аминогруппы получаемого после восстановления сополимера затем превраи1,ают в изотиоцианатиые или диазогруппы, способные реагировать с молекулами фермепта, в качестве которого использовали трипсин. Иммобилизацию трипсина на получаемом носителе можно также осуН1ествлять с помоп1,ью бифункционального

соединения, способного реагировать с аминогруппами носителя и аминогруппами фермента. Недостаток указанного Способа заключается в трудоемкости и Длительности получения конечного продукта (более 4 су ток) и низкой протеолитической активности (13% от исходной) иммобилизованного трипсина.

Целью предлагаемого изобретения является упрои-1,ение процесса и повышение активности иммобилизованных ферментов.

Эта цель достигается за счет активации полимерного носителя привитой сополимеризацией аллиламина в присутствии фосфорной кислоты.

В соответствии с изобретением описывается способ получения иммобилизованных ферментов, заключающийся в том, что процесс позволяет путем привитой сополимеризации на поверхность инертного полимерного носителя под действием ионизирующого излучения аллиламина в присутствии фосфорной кислоты с последующей обработкой привитого сополимера активатором, например глутаровым альдегидом, и раствором фермента.

Реакцию привитой сопопимеризации аллиламина обычно нроводят либо в массе, либо в среде полярных растворителей, нанример, воды, спиртов, кетонов, простых и сложных эфиров и т. п., под действием ионизирующего излучения, например у-излучения или смещанного излучения ядерного реактора, а молярное соотношение аллиламин-фосфорная кислота равно 1 : : 0,1 -10. В качестве полимера, на который прививают аллиламин, используют полиэтилен, полипропилен, полистирол, полимеры диенового ряда, сложные полиэфиры и т. п. Суммарная доза облучения при проведении привитой сополимеризации равна 2-10 -5-10 рад. Гомонолимер отмывают от привитого сополимера 5-50%-ным водным раствором неорганической кислоты, например соляной, серной, фосфорной и т. п.

Иммобилизацию фермента на обработанном глутаровом альдегидом привитом еополимере проводят путем инкубации обработанного привитого сополимера в растворе фермента при физиологических значениях рН и температуре О-50°С. Температура реакции привитой радиационной полимеризации не играет существенной роли, так как степень ирививкие аллиламина определяется дозой облучения и количеством фосфорной кислоты.

Температурный интервал определяется свойствами используемых мономеров и полимеров. Предпочтительно, полимерный носитель должен быть твердым, чтобы сохранять форму, а раствор фосфорной кислоты и аллиламина должен быть жидким, чтобы существовала возможность диффузии мономера к иоверхности полимера. Поскольку для иммобилизации фермента достаточно иметь на поверхности полимера привитой компонент с минимальной степенью полимеризации, то доза облучения не имеет существенного значения. Обычно это доза порядка 0,2-106 рад. Однако для увеличения гидрофильности поверхности носители, без разрущения полимера под действием излучения, можно использовать дозы порядка 5-10 рад. Соотнощение полимер; : аллиламин: фосфорная кислота также нееущеетвенно, так как нривитая сополимеризация ироисходит с поверхности и определяющим будет не вес полимера-носителя, а его форма (пленка, иорощок, изделие и т. п.).

Пример 1. В ампулу помещают полипропиленовую пленку толщиной 0,1 мм и площадью 20 см, 5 г алиламина и 50 г 70%-ной фосфорной кислоты. Ампулу вакуумируют до мм рт. ст., запаивают и

облучают у-лучами дозой 0,5-10 рад при температуре 40°С в течение 30 мин. Гомополимер отмывают от иривитого сополимера 50%-ной фосфорной кислотой и водой. Пленку промывают бикарбонатным

буфером при рП 8,0 и помещают в 10%-ный раствор глутарового альдегида на 3-4 ч при температуре 20°С. Затем пленку промывают бикарбонатным буфером и помещают в раствор 5 мг трипсина в 10 мл бикарбонатного буфера (рН 8,0) на 10 ч при температуре 4°С. Удельная активность иммобилизованного трипсина составляет 43% от активности нативного фермента (субстрат- 1%-ный раствор казеина).

Пример 2. Иммобилизацию а-химотрипсина проводят так же, как в примере 1. Удельная активность иммобилизованного фермента составляет 50% от активности нативного фермента.

П р и м е р 3. В ампулу помещают 3 г порощка полиэтилена, 5 г аллиламина и 70 г 40%-ной фосфорной кислоты. Привитую сополимеризацию проводят так же, как в примере 1. Иммобилизацию трипсина проводят так же, как в примере 1, используя 5%-ный раствор глутарОБОго альдегида. Удельная активность иммобилизованного фермента составляет 37% от активности нативного фермента.

Примеры 4-6. В 3 ампулы помещают по 5 г порощка полистирола, 10 г аллиламина и 100 г 80%-ной фоефорной кислоты. Привитую сополимеризацию и иммобилизацию трипсина проводят так же, как в

примере 1, облучая ампулу у-лучами Со дозой 0,5-10 1-10 и 2-10 рад соответственно в течение 0,5; 1 и 2 ч. Удельная активность иммобилизованных ферментов составляет 37, 29 и 48%от активности нативного фермента соответственно.

Пример 7. В ампулу помеп.ают полипропилеиовую пленку толщиной 0,1 мм и площадью 35 см , 6 г аллиламина и 130 г 80%-иой фосфорной кислоты. Ампулу вакуумируют до мм рт. ст., заиаивают и

облучают улучами Со дозой 510 рад лри температуре 0°С в течение 5 ч. Гомополимер отмывают от привитого сополимера 50%-ным раствором фосфорной кислоты и водой. Пленку промывают бикарбонатным буфером (рН 8,70) и помещают в 25%-ный раствор глутарового альдегида па 2 ч при 0°С. Иммобплизапию трппсипа проводят так же, как в примере 1, прпО°С. Удельпая активность иммобилизованного трипсина составляет 52% активности нативпого фермента.

Пример 8. В ампулу помещают 5 г порошка полистирола, 5 г аллиламина и 1,7 г 50%-ной фосфорной кислоты. Привитую сополимеризапию проводят при 100°С, облучая вакуумпрованную до 10 мм рт. ст. ампулу уЛучами Со дозой 0,2-10 рад в течение 12 ч. Гополимер отмывают от привитого сополимера 50%-ной фосфорной кислотой и водой. Порощок промывают бикарбонатным буфером (рН 7,5) и помещают в 2%-ный раствор глутарового альдегида на 24 ч при 40°С. Затем порощок промывают бикарбонатным буфером и помещают в раствор 5 мг фермента, выделенного из Actinomyces spheroides щт. 1, в 5 мл бикарбонатного буфера (рН 7,5) на 30 мин при 50°С. Удельная активность иммобилизованного фермента составляет 24% от активности пативного фермента.

Таким образом, из рассмотренных прпмеров видно, что предлагаемый способ получения иммобилизованных ферментов позволяет значительно упростить процесс иммобилизапии, расщирить круг полимерных носителей и получать пммобизилованпые ферменты, обладающие достаточно высокой удельпой активпостью. Так, если процесс иммобилизации трипсина привитой сополпмеризации на полипропилен л-нитростирола с последующим восстановлением

нитрогрупп в аминогруппы И обработкой аминосодержащего полимера активатором и раствором фермента занимает более 4 суток и приводит к получению иммобилизованпого трипсина, сохраняющего только 10% активного нативного фермента, то использование предлагаемого способа позволяет в течение 15-24 ч получать иммобилизованные на различных синтетических полимерах фер.менты, в том числе и трипсин, сохраняющие около 50% активности.

Формула изобретения

1.Способ получения иммобилизованных ферментов путем привитой сополимеризадии полимерного носителя с мономером под действием ионизирующего излучения с последующей обработкой полученного при этом прпвитого сополимера активатором и раствором фермента, отличающийся тем, что, с целью упрощения ироцесса и увеличения активности целевого продукта, в качестве мономера используют аллиламин и привитую сополимеризацию проводят в присутствии фосфорпой кислоты.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют аллиламин и фосфорную кислоту в мольном отнощении 1 : : 1,0-10.

3.Способ по и. 1, отличающийся тем, что в качестве активатора исиользуют глутаровый альдегид.

Псточники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Иммобилпзоваппые ферменты. Т. 1. МГУ, 1976, с. 79-140.

2.М. J. Liddy, J. L. Garnett, R. S. Kenyon. Им.мобилизация трипсина на привитом сополимере полипропилена, полученном под действием радмации. «J. Polum. Sci. Synipos, 1975, № 49, 109-116 (нрототип).