Способ выделения комплекса ферментов -глюканазы и амилазы Советский патент 1980 года по МПК C12D13/10 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству ферментных препаратов и используется в производстве ферментов микробного происхождения. Известен способ выделения |Ь 1 «-1,4-глюканазы из культуральной жидкости BaciEeus subtiEis, аключающийся в его осаждении серноки лым аммонием из водно-ацетонового раствора, оставшегося после осаждения фермента амилазы ацетоном 1 Однако при выделении амилазы из культуральной жидкости этого МИ роорганизма по производственному регламенту (ацетоном) фермент -глюканаза почти не осаждается и остается в отходе: в водноацетоновом растворе. Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ выделения амилазы из культу ральной жидкости микроорганизмов путем адсорбции фермента на крахмале 2 . Недостаток известного способа заключается в том, что крахма является дорогостоящим пищевым сырьем. Кроме того, данный сорбе не может быть использован для получения р)-глюканазы. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и расширение сырьевой базы. Поставленная цель достигается тем, что в качестве адсорбирующего материала применяют сульфитную целлюлозу или пшеничную солому, которые вводят в количестве 8-12 % от объема культуральнойжидкости. Указанные сорбенты содержат в качестве основного компонента целлюлозу и являются отходами производства. Способ осуществляется следующим образом. В культуральную жидкость, содержащую ферменты после выращивания микроорганизма, или к раствору ферментов добавляют измельченйЭй целлюлозосодержащий материал, полученную кашицеобразную массу отжимают, фильтруют или центрифугйруют, а затем высушивают на воздухе или роторной сушилке. Полученный препарат является сорбатом ферментов и проявляет свою активность в тех же условиях,как и ферментные препараты,полученные другими способами.

Пример 1. Выделение ферментов путем адсорбции на соломе. Пшеничную солому нарезают и измельчают в шаровой мельнице,, затем полученную муку пропускают через сито (с отверстиями в 0,25 мм ), В качестве ферментов используют лиофильно высушенную культуральну жидкость BaciEEus subtiEis, полученную на Вильнюсском заводе ферметов и содержащую как амилазу, так и (i-1, 3-, 4-глюканазу. Для опыта готовят 1%-ный раствор этих ферментов, осадок нерастворившихся примесей отделяют центрифугированием. К 100 мл раствора ферментов добавляют 10 г измельченной соломы. По истечении 30 мин твердую часть отделяют от раствора путем фильтрования на воронке Бюхнера. В одном случае- полученный сорбат ферментов на порошке из соломы снова разводят

100 мл а цетатного буфера рН 5,Ь 0,1 М, ив полученной суспензии определяют активность ферментов, амилазы и Ь-глюканазы. Во втором случае осадок с воронки Бюхера высушивают на воздухе, и затем осадок замачивают в 100 мл ацетатного буфер и в суспензии определяют активность ферментов. Активность также определяют в фильтрате после отделения осадка.

Активность |Ь -глюканазы измеряют по образованию редуцирующих Сахаров при действии фермента на лихенин, активность амилазы - по снижению йодной окраски раствора крахмала под действием фермента.

Результаты адсорбции ферментов на пшеничной соломе и исследование активности полученных сорбатов приведены в табл.1.

Таблица 1

Исходный ферментный раствор для опыта Ги

Опыт I. Фильтрат Сырой сорбат на солом Опыт II. Фильтрат

Высушенный сорбат на соломе

; Из таблицы следует, что большая часть fb-глюканазы .адсорбируется на соломе и полностью проявляет Свою активность при ее определении в сыром и высушенном препарате.

Амилаза при этом адсорбируется в количестве 67 и 20% и также проявляет свою активность при определении ее в полученных препаратах.

Пример 2. Способ выделения ферментов путем адсорбции на сульфитной целлюлозе.

В качестве ферментов используют яиофильно-высушенную культуральную жидкость BaciEKus subtil is, полученнуй) на Вильнюсском заводе ферментов и содержащую амилазу и р)-глюканазу

6625

100 38,9 2580,0 67,0 4437,.0 6430,0 97

20

1328,9

Для опыта готовят 1%-ный раствор этих ферментов.Осадок нерастворившихся примесей отделяют центрифугированием.

К 100 мл раствора ферментов добавляют 10 г сульфидной целлюлозы. По истечении 30 мин твердую часть отделяют от раствора путем фильтрования на воронке Вюхнера. Полученны сорбат ферментов на порошке из целлюлозы снова разводят 100 мл ацетатного буфера рН .5,5 0,1 М и в полученнойсуспензии определяют активность ферментов: амилазы и глюканазы. Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2 Из таблицы следует, что|Ь-1,3 1,4-глюканаза и амилаза адсорбир из раствора на целлюлозе и проявл 93 и 90% активности при исследова НИИ полученных сорбатов. Предлагаемый способ по сравне известным позволяет в 10-15 раз увеличить выход |Ь-глюканазы в сравнении с существующими методами получения ферментных препаратов путем осаждения ацетоном и серноки лым аммонием,позволяет расширить сырьевую базу для получения ферментных препаратов путем применения измельченных отходов сельского и лесного хозяйства, а также бумажной промышленности; соломы, цветочныхпленрк крупяных культур, лузги, древесных опилок, скопа, отхода бумажного производства, хлопкового линта, хлопковых и вискозных очесов и т.д.,которые в настоящее время не используются и загрязняют среду. Получение комплексного ферментного препарата амилазы и )Ь -глюканазы в виде сорбата на вышеперечисленных материалах исключает необходимость применения NaC, добавляемого в качестве наполнителя, что также снизит стоимость препарата. В отличие от способа получения ферментного препарата путем высушивания на распылительной сушил получаемый сорбат ферментов на перечисленных материалах является ферментным препаратом, очищенным от пигментов и некоторых других балластных веществ мик-. робного происхождения, содержа1ЩИХСЯ в исходной культуральной, жидкости. Измельченный целлюлозосодержащий материал добавляется в культуральную жидкость без предварительного запаривания или другой обработки в отличие от способа получения сорбата амилазы на крахмале, который требует предварительного запаривания в определенном режиме влажности и температуры. Формула изобретения Способ выделения комплекса ферментов (Ь-глюканазы и амилазы из культуральной жидкости Bacitt us subtiEis, путем использования адсорбирующего материала, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и расширения сырьевой базы, в качестве адсорбирующего материала применяют сульфидную целлюлозу или пшеничную солому, которые вводят в количестве 8-12% от объема культуральной жидкости. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Ллекнавичюте Р.К„, Движение В.Ю. Глемжа А.А. Получение Ь Глюканазы Г15Х из отходов производства амилосубтилина Г ЮХ.-Микробиологическая промышленность, вып. 5, 1977, с. 9-11. 2.Мульман М.С. Сорбция амилолитических ферментов.; М.,Пищевая промышленность