Способ выделения целлюлазы Советский патент 1982 года по МПК C12N9/42 

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЛОЛАЗЫ

Изобретение относится к способам выделения ферментных препаратов микробного происхождения и может быть, в частности, использовано для получения высокоактивных препаратов целлюла зы, применяемых в пищевой промышленности, виноделии и медицине. Известен способ выделения ферментов, в том числе целлюлаз, из растворов, предусматривающий осаждение сульфатом аммония из сконцентрированного упариванием раствора П 1. Недостатками этого способа являются сложность регенерации осаждающего агента и низкое содержание целлюлаз в получаемых препаратах, поскольку вместе с целлюлазами происходит осаждение посторонних белков, углеводов, компонентов питательной среды и других примесей. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ выделения целлюлазы из содержащих ее растворов, предусматривающий адсорбцию фермента из охлажденного до 5-13 С раствора с рН 3-6 на сорбент, представляющий собой измельченную-целлюлозу (обычно с размером частиц 10100 мкм, взятую в количестве 0,1-10 г на 50 ед. активности фермента), последующее фильтрование.суспензии и сушку отделенного сорбата 2Д. Недостатками известного способа являются невозможность получения препаратов, содержащих более 500 ед, целлюлазы на 1 г, и низкая начальная активность получаемых препаратов при использовании для переработки твердых видов растительного сырья, поскольку при добавлении их к сырью первоначально происходит гидролиз сорбента, на который осаждались целлюлазы, и лишь затем возможен гидролиз самого перерабатываемого сырья. Цель изобретения - повышение активности целлюлазы. Поставленная цель достигается спо собом выделения целлюлазы, предусмат ривающим адсорбцию фермента на целлюлозе при рН , причем адсорбированный фермент элюируют водой или буферным раствором с рН ,,S и ионной силой 0,0001-0,01 М с последующей сушкой полученного элюата. Обычно используют культуральную жидкость продуцента целлюлазы или экстракт поверхностной культуры, или раствор технического препарата целлюлазы . В качестве адсорбента обычно используют хлопковый линт или некондиционный хлопок. Перед элюцией фермента с целлюлоз обычно осуществляют отмывку адсорбир ванных примесей буферным раствором с рН 3,5-,5 и ионной силой 0,01-2 М. Обычно процесс ведут при . Использование воды или водного раствора с малой ионной силой для см вания адсорбированной целлюлазы явля ется неочевидным, поскольку уменьшение прочности адсорбции ферментов, как правило, вызывается повышением, а не понижением ионной силы, поэтому поведение целлюлаз в данном случае является исключением. Близкие результаты, достигаемые при использовании чистой воды и водных растворов с ионной силой 0,00010,01 М, объясняются тем,, что вода обладает большей способностью к смыванию целлюлаз, но при ее использова нии сильно увеличивается гидродинами ческое сопротивление целлюлозы, что может приводить к уменьшению скорост элюирования почти до нуля еще до того, как весь фермент десорбируется с целлюлозы. Это может приводить к снижению выхода целлюлазы при исполь зовании в качестве адсорбента порошковых форм целлюлозы типа микрокрис таллической. Водные растворы с ионно силой 0,0001-0,01 М, хотя и обладают несколько меньшей способностью к смы ванию целлюлаз при пропускании равно го объема, однако в меньшей степени повышают гидродинамическое сопротивление порошковых форм целлюлозы, бла годаря чему элюцию ими можно проводить до полного отмывания целлюлаз. Способ осуществляется следующим образом. Перед выделением фермента рН ферментного раствора доводят кислЪтой, например уксусной, до 3-6, а ионную силу - подходящей солью, например цитратом натрия, ацетатом натрий, хлоридом калия и т.п. - до 0,00010,01 М. Раствор фермента пропускают через охлажденную до колонку, заполненную целлюлозой, со скоростью 0,1-5 свободных объемов в час. По окончании пропускания раствора фер мента пропускают буферный раствор с рН 3,5-,5 и ионной силой 0,01-2,0 М (1-10 объемов), а затем - воду или водный раствор с рН ,,5 и ионной силой 0,0001-0,01 М. Водную фракцию (1-3 свободных объема колонки) собирают и при необходимости (наличии осадка или сильной опалесценции) фильтруют или центрифугируют для удаления осаждающихся примесей, а затем сушат лиофильно. Полученный препарат целлюлазы содержит 1000-10000 ед. фермента на грамм и почти не содержит пигмента, балластных белков, протеаз, солей и других примесей. В качестве примеси он содержит небольшие количества растворимых Сахаров (глюкозы и целлобиозы), стабилизирующих фермент при хранении. Ферментный препарат легко гидролизует растворимые производные целлюлозы, а также природную целлюлозу (хлопок, отходы древесины и т.д.). Выход по ферменту составляет 80-100. Колонку с целлюлозой можно использовать для выделения целлюлаз 10 и более раз без ухудшения ее сорбционных свойств, пополняя периодически целлюлозой взамен прогидролизованной ферментом. О качестве сорбента можно использовать микрокристаллическую целлюлозу для хроматографии, измельченный и неизмельченный коротковолокнистый хлопок (линт), отходы производства бумаги, отходы вискозной промышленности. Пример 1.2г технического препарата целловиридина ГЗх (продуцент Trichoderma viride) с активностью 30 ед/г (по КМ-целлюлозе) растворяют в 20 мл 0,1 М ацетатного буфера с рН 3,5 и ионной силой 0,01 М при перемешивании в течение 20 мин, затем удаляют центрифугированием нерастворившиеся примеси, В колонку объемом 10 мл (150V10 мм) с водяной рубашкой, охлажденной до , вносят k г микрокристаллической целлюло зы для колоночной хроматографии(производство Chemapot, ЧССР) и уравно вешивают упомянутым буфером. Лдсорбцию целлюлазы проводят пропусканием 20 мл 10 ё-ного раствора целлюлазного препарата через колонку со скоростью 10 мл/ч. Раствор, не содержащий фермента, удаляют из колонки вытеснением упомянутым ацетатным буфером. Пос ле пропускания 100 мл буфера его заменяют на водный раствор однозамещенного фосфата натрия с ионной силой 0,001 И и рН 7, собирают выходящую фракцию объемом 10 мл и сушат ее лиофильно. Выход фермента составляет 80%. Получают 16 мг препарата с активностью 3000 ед/г. Пример 2. Готовят 10%-рый раствор технического препарата целло бронина ГЮх с удельной активностью 100 ед/г (продуцент Trichoderma 1опgibrachiatum) в 0,1 М ацетатном буфере (pH.AjS, ионная сила 0,04,М), как описано в примере 1. В колонку ( мм, объем 300 мл) с водяной рубашкой, охлажденной до , вносят 100 г хлопкового линта, измельченного гечение 5 мин на лабораторной вибромельнице, и уравновешивают упо- Минутым буфером. Пропускают 350 мл раствора целлобронина, затем lOO мл ацетатного буфера, 200 мл 0,1 М фосфатного буфера (рИ , ионная сила 0,2 М) и, наконец, воду со скоростью 50 мл/ч. Собирают водную фракцию объемом 120 мл, центрифугируют для удаления выпавших в осадок примесей и сушат лиофильно. Выход фермента 100%. Получают 600 мг препарата с ак тивностью 6000 ед/г. Пример 3. Готовят 10%-ную водную вытяжку поверхностной культур Trichoderma koningii(препарат целлоконингин Пх, удельная активность 10 ед/г), как описано в примере 1. Добавляют в нее до рН 6 и ионной силы 2 М. В колонку, использо ванную в примере 1, термостатируемую при , вносят 8 г неизмельченного некондиционного хлопка, промывают 2 М раствором КН.Р0, затем пропускают 80 мл целлилазного раствора, а затем воду. В первых 20/мл водной фракции фермента почти нет. Их отбрасывают и собирают следующие 20 мл которые сушат лиофильно. Выход фермента 80% или 60 мг препарата с активностью 1000 ед/г. Пример 4. В культуральную жидкость продуцента Trichodernja 1 ignorun с активностью 0, ед/мл добавляют концентрированную уксусную кислоту и ацетат натрия из расчета 0,1М ацетатного буфера (рН «,5). Для выделения целлюлазы из культуральной ); идкости повторно используют колонку с измельченным линтом из примера 2, отмытую водой и уравновешенную ацетатным буфером. На колонку наносят 1 л культуральной жидкости, далее поступают, как в примере 2. Выход фермента 95% или 95 мг с активностью 000 ед/г. Пример 5. В 100 мл и-ного раствора препарата целлокандина ГЮх (продуцент Geotrichum candidum) с удельной активностью 100 ед/г в 0,1 Н ацетатном буфере с рЙ i,5. использованного для гидролиза растворимой КМ-целлюлозы и содериоцего продукты гидролиза, вносят при перемешивании и охлаждении до С 15 г порошковой целлюлозы с размером частиц 150-250 мкм. Перемешивают 20 мин, затем раствор, не содержащий фермента, удаляют фильтрованием на стеклянном фильтре, а оставшуюся целлюлозу промывают двумя порциями воды по 20 мл. Водные вытяжки объединяют.и сушат. Выход фермента Й0% или ((О мл препарата с удельной активностью 2500 ед/г. Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в том, что способ позволяет лолучить препараты целлюлазы с содержанием фермента 1000-10000 ед/г, обладающие высокой активностью по отношению к растворимым и нерастворимым формам целлюлозы. Получение препарата не требует значительных затрат, так как позволяет многократно использовать сорбент, а в качестве сорбента использовать отходы хлопковой, целлюлознобумажной, вискозной промышленности. Для смывания фермента пригодна обычная вода. В ходе выделения целлюлазы происходит отделение балластных белков, пигмента, компонентов среды культивирования, а также концентрирование в 2-5 раз и обессоливание. Это позволяет исключить процедуры концентрирования разбавленных растворов целлюлазы, культуральных жидкостей и

7

экстрактов при выделении из них фер мента, а также их обессоливание.

Формула изобретения

757968

1 ультуры, или раствор технического препарата целлюлазы.

k. Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что перед элюцией фермента с целлюлозы осуществля 0 ют отмывку адсорбированных примесей буферным раствором с рН 3,,5 и ионной силой 0,01-2 М.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР If , кл. С 12 О 13/10, 1973. М 2. Авторское свидетельство СССР N- 590957, кл. С 12 N , 1975.