Способ получения хиноидного пигментарегулятора метаболизма Советский патент 1980 года по МПК C12D13/10 

Изобретение относится к способам получения микробных метаболитов и производству протеаз тромболитического действия и может быть применено в микробиологической промышленности, медицине, фармакологии и физиологии. Известен способ получения из Aspergillus wentii окрашенных метабо литов, имекицих максимумы поглощения при 270, 295 и 452 им l . Способ состоит в выращивании Aspergiilus wentti поверхностньм методом в течение 2 мае на зерне или рисе или в течение 1 мес - на среде, содержащей дрожжевой экстракт и сахарозу. После этого мицелий отдел5пот от культуральной жидкости, высушивают, размалывают и экстрагируют хлоро формом в аппарате Сокслета. черюз 16 ч экстракции полученный раствор концентрируют при нагревании в испарителе. Хлороф01жюниые экстракты мицелия очищают тонкослойной хроматографией на Adsor bosle-1. Полученны пятна экстрагируют смесью хлороформа и ацетона, растворы концентрируют и подвергают рехроматографии в следующих системах растворителей по порядку: хлороформ - ацетон в соотношении 50:50, толуол - этилацетат - муравьи ая кислота в соотношении 6-4:1, хлооформ - этанол в соотношении 95:5, бензин - эфир в соотношении 5:2. Полученное соединение обладает токсичньии действием на куриные эмбрионы в дозе 50 мг на яйцо. Недостаткс1ми способа являются: длительность способа (1-2 мес); необходимость культивирования продуцента на пищевом сырье (зерно, рис, дрожжевой экстракт), что значительно удорожает производство; получение пигмента из мицелия гриба, что требует высушивания, размалывания и 16-часовой экстракции целевого продукта;- громоздкость и трудоемкость способа. Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ получения из плесневого гриба Aspergillus wen эмодиноокрашенного грибного метаболита антрахиноновой природы 2. Способ состоит в том, что гриб AspergfJlus wentii выращивают поверхносТньм методом на раздробленной пшенице с добавлением дрожжевого экстракта в течение 3 нед при 28 С. Через 3 нед мицелий гриба три раза экстрагируют хлороформом, экстракты фильтруют в вакууме через безводный .; сульфат натрия, фильтрат концентрируют и подвергают хроматографии на силикагелевой колонке в градиенте элюции от толуола к этилацетату. Дальнейшую очистку проводят в системе толуол - этилацетат - муравьиная кислота в соотношении 5:4:1, а затем В системе хлороЛорм - ацетон в cooW ношении 93:7. Эмодин кристаллизуют из этанолового раствора. Полученный препарат обладает величиной , равной 3,7 мг/кг, при концентрациях в 12,2 и 37 мг/кг вызывает гибель од нодневных петушков в 83% случаев, в меньших же дозах возможно медицинское применение эмодина в качестве слабительного средства. К недостаткам прототипа относится длительность культивирования грибапродуцента (21 сут); использование в качестве сред для выращивания продуцента пищевых продуктов, что удорожа ет способ; пигмент-регулятор выделяют из мицелия гриба, что требует определенных операций по его разрушени сложность и громоздкость способа, со стоящего из многих операций; отсутст вие стимулирующего биологического действия на микроорганизмы. Целью изобретения является придание регулятору стимуляторных свойств в отношении биосинтеза протёаз микро организмами, а также ускорение спосо ба. Поставленная цель достигается тем что культивирование продуцента ведут на синтетической среде, содержа1чей сахарозу, глюкозу, КМОз,Мд504 и КпНРО глубинным методом в течение 48-72 ч, а экстракции подвергают кул туральную жидкость, предварительно обработанную ацетоном, причем в каче стве экстрагента используют азеотроп ную смесь хлороформ:этанол:вода в со отношении 91:5:4 или толуол:этанол: вода в соотношении 51:37:12 и элюи-рование экстракта при хроматографии осуществляют смесью бензол:эфир в соотношении 1:1. Сущность способа состоит в том, что для получения хиноидного пигмента оксиантрахиноновой природы исполь зуют культуральную жидкость гриба Aspergillus wentii, штамм 312, Гриб выращивают на известной и простой по составу синтетической среде, содержащей сахарозу, глюкозу, азотнокислый калий, сернокислый магний и двузамещенный фосфорнокислый калий. Культивирование продуцента ведут глубинным способом в течение 2-3 су что существенно сокращает время,затрачиваемое на получение целевого продукта. Вьаделение пигмента осущес вляют не из мицелия, а из культурал ной жидкости, которую обрабатывают ацетоном в соотношении культуральна жидкость ацетон 1:4 - 1:5. Полученн одную фазу высушивают на воздухе до лажного осадка, а затем экстрагирут азеотропной смесью хлороформ: танол:вода в соотношении 91:5:4 или олуол:этанол:вода в соотношении 1:37:12 обезвоживают и отгоняют в акууме досуха. Очистку раствора пигента проводят на активированном иликагеле. Элюирование пигмента существляют смесью бензол-эфир.Поученный пигмент имеет максимумы полощения при 267 и 453 нм и дает хаактерное окрашивание с уксуснокислым агнием, что позволяет отнести полуенное соединение к группе оксиантраинонов.Пигмент по своей природе блиок к эмодину и ализарину. В таблице приведены результаты иологического действия полученного игмента на микроорганизмы. Aspe rg i1 1 u s Ka na gawaensis 6,7 Aspe rg i 1u s Kanagawaens I-s с внесением через 24 ч хиноидного пигмента из культуральной жидкостиAspe rg i1 Iu s wen80,5 1054 tii5,3 Как видно из таблицы, полученный по предлагаемому способу хиноидный пигмент является биорегуляторюм жизненного цикла и процесса биосинтеза протёаз тромболитического действия Aspergillus Kanagawaensis. Введение этого соединения в развивающуюся культуру гриба-продуцента протёаз (Asp.Kanagawaensis) в -момент начала синтеза протёаз (24 ч роста) ведет к значительному в 2,0-2,5 раз увеличению вьлхода протеолитических ферментов, обладающих способностью к растворению тромбов крови человека. Пример 1. В синтетическую среду, содержащую, вес.%: сахарозу 0,72; глюкозу 0,36; KNO 0,2; MgSO 0,123 и KjHPO, 1,37, после стерилиза