оо да to
01 Изобретение относится к микроби логии и касается npj, ания антибио тиков. Предложенный антибиотик новый и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан. Целью изобретения является получ ние антибиотика общей формулы где R обозначает -СО-ОНо-СН ; -CO-OH IJ. -CO-GHjCHj-CHj, или -CO-CH,. iCHj Указанная цель достигается тем, что штамм Nocardia sp. I С-15003 (АТСС-31281, IFO 13726) выращийают в питательной среде, содержащей источники , углевода, добавки валина или изомасляной кислоты или их производных, с последующим выделением целевого продукта. Кроме того, в качестве добавки используют смесь валина и изомасляной кислоты. Штамм Nocardia sp. C -15003 продуцент антибиотика - выделен из почвы и депонирован в исследовательском институте ферментации Agercyof Industrial Science and ,Techno logy (FERM) под номером 3992, в институте ферементации, Осака (IFO) под порядковым номером 13726 и в американской коллекции разновид ностей культур (АТСС), Мэриленд США под номером АТСС-31281. Морфологические признаки. Вегетативный мицелий хорошо рас тет как на агаре, faK и в жидкой среде. Гифы достигают от 0,8 до 1,2 мкм в диаметре, в некоторых слу чаях их можно разделить на фрагмен ты, напоминающие палочки бактерий или короткие разветвленные гифы.Шт ,хорошо растет на различных средах, образуя тела, похожие на монолиты (50-200x200x1000 мкм)на которых пр должается дальнейишй рост воздушно мицелия. Воздушный мицелий представ ляет собой волнообразные прямые или петлеобразные спирали,, В Hekoторых случаях образуются конидии. Клеточные суспензии, полученные с поверхности культур, содержат мно го удлиненных эллипсоидальных (0,08 1/2x4,8-6,8 MKMj и эллипсоидалыпЖ (0,8-1,2x1,0-2,0 мкм) телец,похожих на гфтроспоры. Штамм хорйшо растет на раз/1ичных средах, причем вегетативный мицелий бывает от бесцветного до бледножелтого в начальных Фазах и от светлого желтовато-рыжевато-коричневого до желтовато-рыжевато-коричневого на поздних фазах. Штамм продуцирует растворимые пигменты в различных средах. Воздушный мицелий имеет порошкообразный вид и обладает уменьшенным ростом, цвет его варьируется от -белого до желтого или от светлого желтов то-рыжевато-коричневого. Сахарозо-нитратный агар. Рост умеренный, вегетативный мицелий (ярко желтый цвет дыни до янтарного рыжевато-коричневого) образует тела, похожие на монолит. Воздушный мицелий скудный, белый. Растворимый пигмент отсутствует или бледный желтовато-рыжевато-коричневый. Глицёрино-нитратгедй агар. Рост умеренный. Вегетативный мицелий светлый, цвета слоновой кости, образует тела, похожие на монолит. Воздушный мицелий умеренный, белый. Растворимый пигмент отсутствует. Глюкозо-аспарагиновый агар. Рост умеренный, вегетативный мицелий от яркого цвета календулы до ярко-желтого. Воздушный мицелий скудный, белый. Растворимый пигмент яркожелтый. Глицериново-аспарагиновый агар. Рост умеренный. Вегетативный мицеЛИЙ цвета светлой слоновой кости, образует тела, похожие на монолит. Воздушный мицелий скудный, белый. Растворимый пигмент отсутствует. Агар на крахмале. Рост умеренный. От светлой слоновой кости до светлопшеничного, образует тела, похожие на монолит. Воздушный мицелий обильный, цвета светлой слоновой кости. Растворимый пигмент отсутствует. Агар на овсяной муке. Рост умеренный, от светлой слоновой кости до колониального желтого, образует тела, похожие на монолит. Воздушный мицелий скудный, от белого до светло-желтого. Растворимый пигмент отсутствует . Гирозиновый агар. Рост умеренный, от светлой слоновой кости до цвета светло-желтой дыни, образует тела, похожие на монолит. Воздушный мицелий умеренный, от белого до светлой слоновой кости. Растворимый пигмент цв.ета верблюда. Физиологические признаки. Температурт1й ; интервал роста 12 . Температурный интервал, в котором наблюдается хороший рост ВОВ душного мицелин, 20-35с. Желатину разжижает, крахмсШ гидройизует, нитраты восстанавливает, молоко пептонизирует, но не коагулиРУет, казеин разлагает. Наагаре с пептоном и дрожжевым экстрактбмгмеланоидные пигменты не продуцирует, на тирозиновом агаре образует. Тирозин разлагает, ксантини гипо|ксантин не разлагает, толер тность к лизоциму положительная, толерантность к .хлористому натрию 2%, очень хорошо усваивает фруктозу, маннозу, Хорошо растет на глюкозе, сахарозе, маннитоле, на растворимом крахмале.;. Усваивает ксилозу, арабинозу; трегалозу, мелибиозу, рамнозу, галактозу. Слабо усваивает раффинозу, мальтозу, не усваивагет i-инозитол, D-сорбйтол, лактозу, глицерин. ... Микроорганизм рода Noса rdta может как. вообще все ми сроорганизмы, подвергаться вариациям,и мутациям, которые происходят либо самопроизвольно, . либо вызываются искусственным путем. Так, например,. многочнслен 1ые вариан ты , Которые можно получить при облучении рентгеновскими лучами,/ гамма-лучами, ультрафиолетовым излучением -и т.д., путем выделения отдел ной клетки, путем выраичивания культуры на средах, содержащих различные химические вещества, или в результате любой другой мутагенной обработки та же, как и мутанты, рпонтанно образующиеся из штамма, не следует рассматри .вать как представителей какого-либо иного вида. Любые из таких вариантов или мутантов, способные вь абатывать С-15003 Р-3, Р-3 и/или Р-4, можно использовать дяя целей предлагаемого изобретения.. Так, например, штамм , С-15003 можно подвергать различным му.т are иным обработкам и получать мутанты, которые практически не обладают спюсоб ноет ью продуцировать растворимые пигменты: мутанты с бесцветным субстратными мицелиями, с желтовато-зеленым, красновато-рыжеватокоричневым или оранжево- красным мицелием; мутанты/ гифы которых готовы к фрагментации в бациллярные элементы или в фрагменты коротких разветвленных гифов j и. мутанты с обильньнл бельм воздушным мицелием или практически без воздушного мицелия. f В качестве дрподнителтьных веществ могут использоваться валин и/или изомасляная кислота в виде производных. Примерами производных являются сложные эфиры, такие как С,-С алкиловые .сложные эфиры (например, метиловый эфир,-ЭТИЛОВЫЙ эфир) указанных соединений, амиды, такие как амид или алкиламид {например,Н-метиламид :П-этиламид) Указанных соединений, их кетокислоты (например, 6t -кетоизовалериановая кислота), соли упомянутых соединений, такие как гидрохлорий, натриевая соль, калиевая или кальциеjвая соль, Валин может бытьиспользован в виде. D-формы, L-формы или DL-формы. Упомянутые аддитивные вещества могут представлять собой смеси валина, изомасляной кислоты и/или их «производных. i Указанные вещества обычно добавляют к среде в количес11ре от 0,01 до 1,0% (вес.../объем), и предпочтительно от около 0,1 до около О,5%(вес./объем) в любое время культивирования по мере осуществления культивировйния вида Nocardia С-15003, предпочтительно на начальной стгщии культивирования. Среда, для культивирования может быть как жидкой,- так и твердой и может содержать источники углерода и аз.ота, которые штамм усваивает и переваривает, неорганические вещества, питательных веществ, В качестве источников углерода используют глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, декстрин, крахмал, глицерин, маннитол, сорбитол, жиры и масла (например, масло из соевых бобов, свин)е . сало , куриньй жир). В ка-, честве источников азота используют мясной экстракт, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи,, соевую муку,жидкость от замрчивдния зерна, пептон, мук5 из; хлопковых семян, мёяас 5у, мочевину, аммониевые соли (например, сульфат аммония, хлористый аммоний, нитрат аммония), соли азотной-кислоты (нитрат натрия, нитрат калия). Кроме того, среда может содержать соли натрия, калия, кальция, магния, железа, марганца, цинка, кобальта, никеля, соли фосфорной и борной кислот. Среда может также содержать в качестве добавок различные витамины (например В, Во, никотиновую кислоту , с, ), нуклеиновые кислоты-. (например, пурин, пиримидин и их производные). Для установления рН в среду дббавляют неорганические кислоты и /и ли щелочной металл или , соответствующие основания в качестве регулирукжщх рН агентов, а.также масла, жиры, поверхностноактивные вещества и противовспенивакяцие агенты. Культивирование проводят в любых стационарных условиях для выращивания культур со встряхиванием/аэробным погружением и других. Предпочтительным является аэробное погружв- .. Инкубирование осуществляют при 20-35°С при начальном значении рН |5,5-8,5. Предпочтительным является интервал от 23 до при рН 6,5-7,5. Время культирования 48-240 ч. Штамм С-15003 инокулируют в культуральную срепу 1, в которую входят. %; растворикый крахмал 3; хлористый аммоний 0,2; сульфат магния 0,05; монокалийфосфат 1,09} дикалийфосфат 2,09 сульфат железа 0,001 и допол- нительные вещества; или в культуральную среду 5 , в которую входят, %: декстрин 5; жидкость от замачивания зерна 3; пептрн 0,1;кар|бонат кальция 0,5 и дополнительные вещества. Затем инокулированную среду культивируют 200 об/мин при 28 С в течение 144 ч на ротаторном вибраторе или ферментёре. Результаты, полученные для сред 1Ги Н , приведены в табл. 1. Активность антибиотика определяют при помощи бумажного диска для количественного определения на Talaromyces-avellaneus IFO 7721 в качестве опытного организма. Так как антибиотик, полученный в ферментационном бульоне, является ли пофильным нейтральным веществом,, его выделяют из бульона. Антибиотик Р-3 экстрагируют из питательного фильтра та несмешивающимися с водой органическими растворителями, такими как сложные эфиры жирных кисЛот Л например, этилацетат и амилацетат), спирты (например, бутанол), галоидирован ные углеводороды (например, дихлорметан, хлороформ), и кетоны,(наприме метилизобутилкетон). Э сстрагирование антибиотика Р-3 из фильтрата проводят при рН близком к нейтральному, и предпочтительно экстрагируют этилацетатом при рН 7, Экстракт промываю водой и концентрируют при пониженном давлении. Затем к концентрату добавляют неполярный растворитель, как петролейный эфир или гексан, и выуделяют цсырой продукт, содержащий активное соединение в виде осадка. СЫРОЙ продукт при желании подвергают последовательно различньом способам очистки. Может быть использована адсорбционная хроматография, в качестве адсорбента используют силикагель, окись алюминия, макропористые нёионные смолы. Р-3 из сырого продукта выделяют на силикагельном хроматогра фе с помощью петролейного эфира и гексана и элюируют, добавляя полярный растворитель (такой, как этилацетат, сщетон, этанол или метанол), или гёлоидированный углеводород (такой,как дихлорметан или хлороформ содержащий полярный растворитель, как спирт (например, метанол или эта нол ), кетон (например, ацетон или метилэтилкетон ), Бели в качестве средства очистки антибиотшсл используют макропористую;, смолу - адсорбея то эЛкнрование антибиотика Р-3 проводят смесью воды с низшим спиртом, ,низшим кегоном или сложным эфиром. В. качестве низшего спирта используют метанол, этанол, пропанол или- бутано, а в качестве низшего кетона ис пользуют ацетон или метилэтилкетон. Сырой продукт растворяют в 60%-ной смеси метанол - вода и адсорбируют на колонке с Диапоном НР-10, Колонку промлвают 70%-ной смесью метанол вода и затем проводят элюирование 90%-гной смесью метанол - вода. Фракции, содержащие антибиотик Р-3, собирают и концентрируют при пониженном давлении . К сухому продукту добавляют 5-8 объемов этилацетата и полученную смесь оставляют выстаиваться, после чего выделяют кристаллы антибиотика Р-3, выход составляет 90%. физико-химические свойства Р-3 приведены ниже. Антибиотик С-15003 Р-3. CjjH.jCJNiOg 635,169. Точка плавле- ния 190-192С, Удельное вращение (ct)|,2 -136±10(С 0,375 СНС:4зЬ Найдено, %: С 60,06; Н 7,04; N 4,33; CI 5,37. Вычислено, %: С 60,51; Н 6,82; N 4,41; CI 5,58. Ультрафиолетовый спектр поглощения в метаноле,, нм (): 233 (30250); 240 (пл. 284S5; 252 (27640) ; 280 (5750) ; 288 (5700}, Инфракрасный спектр поглощения, CM-, КВг: 1740; 1730; 1670; 1580; 1445; 1385; 1340; 1255; 1180; 1150; 1100; 1080; 1038. Спектр ЯМР 100 МгГц в ./млн: 1,27/д/ (ЗН); 1,28/д/ (ЗН). Масс-спектр, т/е: 573; 485; 470; 450. Нерастворим в петролейном эфире, гексане и воде.- Частично растворим в бензоле и эфире. Растворим в хлороформе, этилацетате, ацетоне, этаноле, метаноле, пиридине, тетрагидрофуране и диметилсульфоксиде. Цветовая реакция: Драгендорф положительная; Бельштейн - положительная. Биологическая активность. Антибактериологическая активность. По способу бумажных дисков определяют ингибирующие концентрации штамма, выращенного на триптиказно-соевом агаре (BBL) против микроорганизмов, перечисленных далее. Так, диски фильтровальной бумаги (Тоуо Seisakusho, тонкого типа, 8 мм в диаметре), пропитанные каждый 0,02 мл раствора концентрации 300 мкг/мл Р-3, помещают на пластины, инокулированные соответственно микроорганизмами/ перечисленными ниже, для определения минимальной ингибирующей концентрации, Р-3 не обладает активностью против следующих микроорганизмов: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus miratoilis, Pseudomonas aerugiaosa, Staphylococcus aureus, Bacullus subtilis. Bacillus cereus, Klebsiel la pneumonia e, Serratia marcescens И Mycobacterium avium, С другой стороны, рост грибков Talaromyces avellaneus ингибируется Р-3 на агарной пластинке, содержаще 3,5 г динатрийфосфата, 0,5 монокалийфосфата, 5 г кислого фосфата, дрожжевого экстракта (Difco), 10 г глюкозы, 15 г агара, 1000 мл дистил лированной воды, рЧ 7,0. Минимальная ингибирукнцая концентрация3,0 мкг/мл для Р-3. Далее культивируют в качестве исследуемого органи ма mTaiviM Tetrahymena pyriformis W на опытной среде, состоящей из 20 г протеозо-пептона Difco), 1 г дрожжевого экстракта, 2 г глюкозы, 1000 мл дистиллированной воды и 10 МП 1м фосфатного буфера, рН 7,0, при температуре в течение 4448 ч и определяют методом последова тельных разбавлений активность инги бирования роста Р-3 против простейших. Оказалось, что ингибирование роста наблюдается при концентрации 1 мкг/мл. Р-3 обладает активностью против следующих микроорганизмов: Fusicladium Ievieri, Helminthosporium sigmoidium yar. i r regjj 1 a re , Pyricularia oryzae, Cochlioborus raiyabeanus ,Scherotinia sc rerot i orum Pellicularia Sasakii, Trichophyton .rubrum, Rhadotorula rubra и Cryptoco.ccus .neoformans. Противоопухолевая активность. Исследовано терапевтическое дейс вие Р-3, вводимого внутрибрюшинно в течение 9 дней, против лейкемии Р388 у мышей (1x10 клеток) на живо ное, мьЕИь,. трансплантированных внут рибрюшинно. Полученные результаты показали, что в единицах степени продления продолжительности жизйи эти соединения обладают противоопухолевой активностью поряд1 а 200% при уровне дозы 0,00625 Мк/кг/день. Токсичность. В проведенных на мышах тестовых испытаниях на острую токсичность, которые предусматривали внутрибрюшинные инъекции Р-3, все исследован ные антибиотики дали величину LD.j 0,625 мг/кг и LDf, 0,313 мг/кг; Пример 1. 40 МП засеянной культуральной среды, содержащей, %s глюкоза 1,0; бактотриптон 2,0; бакто-дрожжевой экстракт 1,2, рН 7,0, выливают в 200-миллилитровую колбу Эрленмейера. После стерилизации в среду инокулируют Nocardia SP № С-15003 (IFO 13726, АТСС 31281, FERM Р 3992). Инокулянт инкубируют при во вращающемся шейкере ,(200 об/мин) для получения засеянно iкультуры. Засеянную культуру трижды .промлвают стерилизованной дистиллир ванной водой и промытые клетки выде ляют до исходного количества стери лизованной дистиллированной водой. Одну часть по объему полученного вещества инокулируют в основную в 40 ч. по объему основной питателы-гой среды, содержащей, %: растворимлй крахмал 3; хлористый аммоний 0,2} сульфат магния 0,05; монокалийфосфат 1,09; дикалийфосфат 2,9; сульфат железа 0,001 и L-валин 0,1, и основную питательную среду культивируют лри 28с в течение 8 дней во вращаюшемся шейкере (200 об/мин). Общее количество полученного С-15003 составляет 16 мкг/мл, 95% (вес/вес.%) из него составил Р-3. Пример 2. Готовят посев . культуры аналогично примеру 1,500 мл засеянной культуры инокулируют в 2000-миллилитровую колбу Сакагуши и .культивируют при .3 течение 48 ч во вращающемся шейкере (100 об/мин) до получения инокулянта. Инокулум помещают в 100x103 ч по объему среды содержащей, %: Глюкоза 2,0; растворимЕлй крахмал 3,0; жидкость от замоченного зерна 1,0; соевая мука 1,0; полипептон 0,5; хлористый натрий 0,3; карбонат кальция 0,5; рН 7,0, в 200x10; ч по объему ферментер из нержавеющей стали., Культивирование проводят при в течение 48 ч при скорости аэрации 100x103 ч по объему/мин и разкюши вании 200 об/мин. Питательный Оульон (10x10 об.ч.) переносят 100x10 ч по объему основной питательной среды, содержащей, %г декстрин 5; жидкость от замачивания зерна 3| пептон 0,1 L-валин 0,5; карбонат кальция 0,5, рН 7,0, - в 200х1оЗч по объему ферментер, из нержавеющей стали, и культивируют в течение 4 дней при 28с при Ькоросгя аэрации 100x10 ч по объему/мин и скорости перемешивания 150 об/мин. Полное количество полученного С-15003 12 мгк/мл, причем Р-3 в С-15003 составляет около 98% (вес./вес.%). П р и м е р .3. К 95 л жидкой питательной среды, полученной в примере 2, добавляют 50 л ацетона.Полученную смесь перекашивают в течение 30 мин, добавляют 2x10 ч Hyflo-supercell, хорошо перемешивают, затем отфильтровывают на фильтре под давлением, в результате получают 135 я фильтрата. К полученному фильтрату добавляют 50 мл sona и 90 л этилацетата, полученную смесь перемешивают и экстрагируют. Описанную процедуру повторяют двгмсды. Полученные слон этилацетата объединяют и дважды промывают 80-литровыми порциями воды. К слою добавляют 1x10 ч. безводного сульфата натрия, высушивают и концентрируют до 200 МП. К получениому ко1Ш«н рату добавляют петролейный эфир, и о&разовавшийся осадок выделяют фильтрованием, в результате чего получают 35 г сырого продукта. К сырому продукту добавляют 50 м этилацетата и полученную смесь пере мешивают. Нерастворимую часть выделяют фильтрованием, к фильтрату добавляют .10 г силикагеля. пере мешивания полученной смеси Ьтилаце. тат отгоняют при пониженном давле.нии. Остаток помещают в верхнюю час колонки .с силикагелем {500, мп),Элюи рование проводят последовательно 500 МП н-гексана} 500. мл смеси н-гё сан-этилацетат (3:l)f2000 мл смеси н-гексан-этилацетат (1:1) и 2000 мл насыщенного водного раствора этилац тата. При этом элюат собирают в . 5о-миллилитровые фракции. По одному миллилитру от каждрй фракции концентрируют досуха и к полученному концентрату добавляют 0,1 мл этилацетата до получений смеси. Смесь дает пятно на расстоят НИИ 2,5 от нижнего края пластины силикагель - стекло и проявляется около 17 см этилацетатом, насыщенным водой. проявления проводят .определение , ультрафиолетом (2537 А). Активные фракции Rf 0,42 собирают и концентрируют при пониженном давлении до 2 мл. К этому ко дентрату добавляют 20 мл петролейного эфира, в результате чего получают 9,1 ч. сырых кристаллов. После растворения сырых кристаллов в 20 м теплого этилацетата и охлаждения выделяют 0,85 ч. кристаллов Р-3. Точка плавления 189-190 С (р-3 : 97% (вес./вес). П р и ме р 4. В 400 мл 50%-«Hoi1 Раствора-метанола растворяют 20 г гсырого продукта, полученного по при меру 3. Колонку 2,5 см в диаметре наб,ивают 1000 млдааиона -НР-Ю с 3000 мл 50%-нойсмеси метанол - вод Приготовленный таким образом райтвор образца пропускают через колонку и промывают, используя 1000 мл 60%-ного метанола, и осуществляют непре.рывное градиентное элюирование 7500 мл 60%-ной смесью метанол - во да и 7500 мл 95%-ной смесью метанол вода. Злюат собирают в 75 миллилитровые фракции и каждую фракцию исследуют тонкослойной хроматографией на ; иликагеле, описанной в примере 3 Фракции 145-153 собирают и концентрируют. К полученному концентрату добавляют 508 МП йоды и 1000 мл этилацетата. Затем раствор встрях вают в разделительной воронке, и вод ный слой отделяют после двукратного промывания 300 мл воды., зт ил ацетатный слой .высушивают .над безводнь а сульфатом натрия, концентрируют и оставляют отстаиваться. Полученные кристаллы Р-3 отфильтровывают и в асушивают.- ВЫХОД Р-3 880 мг. . Точка плавления 188-190°с(Р-З-; 95% (вес/вес).. Пример 5. Ирпользуя вместо Ь-валина по примеру 1,метиловый эфир валина; N-метиловый эфир валина; гидрохлорид валина;:Ь-кетоизовалериановую кислоту; метиловый эфир изомасляной к.ислоты; N-метиловый эфир изомаслянрй кислоты или смесь вгшина и изомасляной кислоты., получают антибиотик Р-;3. Антибиотик Р-3 обладает высокой ингибирующей активностью против грибковых и простейших организмов и может быть использован в качестве фунгицидного агента, а также может найти применение в качестве противоопухолевого лекарства. Как фунгицид его можно использовать для оценки бактериальной экологии в почве, активном иле, жидкости животных организмов и т.д. Так, если нужно выделить ценные бактерии из образцов почвы или оценить действие бактерий независимо от грибковых или простейших организмов при.работе и исследовании активных илистых систем, используемлх для очистки сточных вод, то можно использовать антибиотик для получения селективного роста бактериальной флоры, српровождающегося подавлением роста загрязняю№х грибк9вых. или простейших , организмов в образце. Обычно образец добавляют, к жий1кой или твердой среде и -на 1 МП среды добавляют 0,1 мл раствора, соде зжащего 10-100 мкг/мл антибиотика в 1%-ной смеси метанол вода, после чего образец инкубируют. Р-3 можно также использовать в качестве бактерицидного агента для борьбы с болезнями растений, вызванными ми крооргайизмами упомянутыми выше. Обычно р-3 используют в виде 1%-ного метанального водного раствора, содержащего 0,5 - 5 мкг/мл антибиотика. Так, например, Р-3 можно использовать для контроля за красновато-коричневой листовой гнилью бластом, ёлйминтоспориоз.ной пятнистостью истьев и листовыми заболеваниями исовых растений. Предлагаеквлй способ позволяет олучить новый антибиотик. но В графе Время добавления аддитивное вещество добавлев среду в качестве одного из ингредиентов.
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА С-15003 Р-3, отличающийс я тем, что штамм Nocardia sp. С-15003 (АТСС-31281, IFO 13726) выращивают в питательной среде, содержащей источники азота, углерода, добавки валика или изомасляиой кислоты или их производных, с последующим выделением целевого продукта. 2. Способ по п.1, отличающий с я тем, что в качестве добав ки используют смесь валика и изомасляной кислоты.
