Способ получения компонентов А @ ,А @ ,А @ ,А @ ,В @ или В @ антибиотического комплекса ВВМ-1675 , обладающих антимикробным и противоопухолевым действием, штамм актиномицета АстINомаDURа VeRRUcoSoSpoRa АТСС 39334 и штамм актиномицета АстINомаDURа VeRRUcoSoSpoRa АТСС 39638, используемый для получения компонентов А @ ,А @ ,А @ ,А @ ,В @ или В @ антибиотического комплекса ВВМ-1675 , обладающих антимикробным и противоопухолевым действием Советский патент 1987 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/03 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к производству антибиотиков.

Целью изобретения является выявление штаммов-продуцентов и разработка способа получения нового антибиотика, обладающего антимикробным и противо опухолевьм дейс тв нем.

Для осуществления способа используют штамм Actinomadura verrucosor spora, который вьщелен из пробы почвы, собранной в Аргентине. Штамм депонирован в Американской коллекции типовых культур под номером АТСС 39334. Иа данного штамма получен му- тантный штамм, который депонирован в той же коллекции под номером АТСС 39638.

Штамм АТСС 39334 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Образует как субстратньй, так и воздушный мицелий. Субстратный мицелий - длинные, разветвленные, нефраг ментированные волокна. Воздушный мицелий - короткие цепочки спор образуются моноподиально или на концах гифов; ответвления в виде завитков, цепочек спор также набгаэдаются вблизи концов гифов спороносные цепочки содержат от 2 до 10 спор в цепочке прямой,извилистой или крючкообраз- ной формы. Споры имеют бородавчатую поверхность, от сферической до эллиптической формы с округлыми или остроконечными концами размером 0,5-0,6 X 0,6-1,4 мкм. После созревания каждая спора часто отделяется пустой оболочкой. Подвижные споры, спорангии или склеротические гранулы не видны.

Агар с триптоном и дрожжевым экстрактом (tSP № О - рост обильный, хлопьевидно-опущенньй, седиментиро- в анный, непигментиров анный.

Среда Чапека - рост умеренный, субстратный мицелий бесцветньй, воздушный мицелий скудньй, слегка серьй (264) до бледно-розового (), растворимьй пигмент отсутствует.

Агар с глюкозой и аспарагином - рост умеренньй, субстратньй мицелий бельй (263) до глубокого, желтовато-розового (27), воздушньй мицелий отсутствует или очень скудный, бледно-розовый (7). Растворимьй пигмент отсутствует.

Агар с глицерином и аспарагином (ISP Н 5) - рост плохой до умеренного, субстратньй мицелий бесцветньй до слегка желтовато-розового (28), воздушный мицелий плохой, слегка желтовато-розовьй (28) , после 5 мес слегка голубовато-серый ( 190. Растворимый пигмент отсутствует. Агар с неорганическими солями и крахмалом (ISP № .4) - рост обштьньй, субстратньй. мицелий желтовато-бельй (92), воздушньй мицелий обильньй, . слегка розовый (4) до розовато-серо- го (Ю). Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с тирозином (ISP № 7) - рост умеренньй, субстратньй мицелий желтовато-белый (92), воздушньй мице- ЛИЙ плохой, слегка желтовато-розо- Вьй (28), через 5 мес частично слегка голубовато-серьй (190), Растворимьй пигмент отсутствует.

Питательньй агар - рост плохой до умеренного.

Субстратньй мицелий бледно-желтьй (89) , воздушньй мицелий отсутствует. растворимьй пигмент отсутствует.

Агар с дрожжевым экстрактом и солодовьм экстрактом (ISP № 2) - рост обильньй, субстратньй мицелий бледно-желтый (89), воздушный мицелий плохой, белый (263) . Растворимьй пигмент отсутствует. Агар с овсяной мукой (ISP № З) - рост умеренньй, субстратньй мицелий бесцветный до бледно-розового (7), воздушньй мицелий плохой, розовато- белый (9) до слегка голубого (l90), растворимый пигмент отсутствует.

Агар с пептоном, дрожжевым экстрактом и железом (ISP № б) - рост умеренный, субстратньй мицелий бесцветный, воздушный мицелий от.сутству- ет, растворимьй пигмент отсутствует.

Культуральные признаки выявлены после инкубирования при З7 с в течение 3-х недель.

Цвет и номер цветового стандар- та: Kelly K.L., D ,В. Judd : .1 SCC-NBS color-name charts illustrated with Centroid colors. US Dept. of comm, cir.553, Washington, D.C., nov 1975,

Физиолого-биохимические свойства: максимальный рост при 28-37 С, умеренньй при 20 и 43 С, не растет при 10 и 47°С (на агаре Беннета, рН 5,0-9,5.

31

Желатину сжижает. Крахмал гидро- лизует. Снятое молоко не коагулируе полностью пептонизирует, Меланоид- ный пигмент не образует. Нитраты в нитриты не восстанавливает.

Растет при концентрации NaCI 5% и менее; при 7% - рост отсутствует.

Устойчив к лизоциму - рост при 0,01% и менее; при 0,1% рост отсут- ствует.

Утилизирует глицерин, арабинозу, D-ксилозу, D-рибозу, L-рамнозу, О-глюкозу, О-фруктозу, сахарозу, целлобиозу, трегалозу, крахмал, целлюлозу, инозит, О-маннит; не утилизирует D(-)-арабинозу, D-галактозу, О-маннозу, L {-)-сорбозу, лактозу, мелибиозу, раффинозу, D {+).-млитозу, дульт ит, D-сорбит, салицин.

Наблюдения после инкубирования при в течение 3-х недель.

Счисленная клеточная стенка содержит мезодиаминопимелиновую кислоту, глицин отсутствует. Присутствует ма- дуроза, глюкоза и ритоза, главные компоненты менахинона идентифицированы как МК-9(Нй) и МК-9(Нз). Клеточная стенка типа lUg .

Мутантный штамм АТСС 39638 ixa- рактеризуется следуюш;ими признаками

Культурально-морфологические признаки.

Морфология сходна с исходным штаммом. Агар с триптоном и дрожжевым экстрактом (ISP № О - рост умеренный хлопьевидно-опущенный, седиментированный и непигментированный.

Среда Чапека - рост плохой. Субстратный мицелий бесцветный, воздушный мицелий отсутствует или скудный, розовато-белый (9), растворимьй пигмент отсутствует.

Агар с глюкозой и аспарагином - рост плохой. Субстратный мицелий бесцветный, воздушный мицелий отсутствует или очень скудный, белый. Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с глицерином и аспарагином (ISP № 5) - рост умеренный. Субстратный мицелий слегка желтовато-розовый (28), воздушный мицелий умеренный, белый до слегка розового (4). Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с неорганическими солями и крахмалом (ISP № 4) - рост умеренный, субстратньй мицелий желтовато- розовый (28); воздушный мицелий умеренный, слегка голубовато-серый (190), Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с тирозином (ISP № 7) - рост умеренный. Субстратный мицелий интенсивно .желтовато-розовый 26, воздушный мицелий умеренный, белый, слегка розовый (.4). Раствори

ный пигмент отсутствует.

Питательный агар - рост плохой. Субстратный мицелий бесцветный до

бледно-розового (7); воздушный мицелий отсутствует. Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с дрожжевым экстрактом и солодовым экстрактом (ISP № 2) - рост обильный. Субстратный мицелий интенсивньш желтовато-розовый (2б); воздушный мицелий плохой, белый до бледно-розового (7). Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с овсяной мукой (ISP № З) - рост плохой. Субстратный мицелий бледно желтовато-розовый (31); воз- душный мицелий очень скудньй, ярко бледно-голубой (184). Растворимый

пигмент отсутствует.

Агар с пептоном, дрожжевым экстрактом и железом (ISP № б) - рост обильный. Субстратный мицелий бесцветный, воздушный мицелий и растворимый пигмент отсутствует.

Физиолого-биохимические признаки.

Усваивает глицерин, L (+)-арабинозу, О-ксилозу, L-рамнозу, D-глюко- ЗУ, D-фруктозу, сахарозу, целлобиозу, трегалозу, крахмал, целлюлозу, D-маннит; не усваивает D(-(-арабинозу, 0-рибозу, D-галактозу, О-маннозу, L (-(-сорбозу, лактозу, мелибио- зу, раффинозу, D(1)-мелицитозу, дуль- цит, инозит, О-сорбит, салицин.

Остальные свойства аналогичны штамму АТСС 39334.

Пример 1 . Штамм Actlncxnadu- га verrucosospora АТСС 39334 выращивают и поддерживают на скошенном агаре, содержащем,%: солодовый экстракт 1; глюкоза 0,4; дрожжевой экстракт 0,4; карбонат кальция 0,05, агар 1,6. Культуру используют для иноку- лирования вегетативной среды, содержащей, %: растворимый крахмал 3; сухие дрожжи 0,3; КНгРО 0,1; гептагидрат сульфата магния 0,05,

NaCl 0,2,- CaCOj 0,1. pH среды до стерилизации 7,0. Посевную культуру выращивают при 32 С в Течение 72 ч на вращающемся встряхивателе С250 об/мин); 5 мл посевного материала переносят в 500 мл колбу Эр- ленмейера, содержащую 100 мл ферментационной, среды, состоящей, %: тростниковая меласса 3; кукуруз- нь;й крахмал 1 ; рыбная мука 1 ; CaCOj 0,1; CuS04 5HiO 0,005. рН до стерилизации 7,0. Ферментацию ведут при 28°С в течение 6 дней на вращающемся встряхивателе

При проведении процесса в фермен таторах 500 мл посевного материала переносят в 20-литровые баночные ферментаторы, содержащие 10 л ферментационной среды. Ферментацию проводят при 32 С при скорости аэрирования 12 л/мин Ст.е.1,2 л воздуха/мин/л среды) и скорости перемешивания 250 об/мин.

После 68-76 ч ферментации максимум образования антибиотика 0,9 мкг/мл.

При проведении ферментации в 200-литровом ферментационном танке процесс ведут при , 164 об/мин скорости аэрирования 0,66 л воздуха/л среды/мин . Величина рН среды постепенно поднимается в процессе ферментации и достигает 7,7-7,8 через 170-180 ч, пик антибиотической активности достигает 1,7 мкг/мл.

П р. и м е р 2. Вьоделение и очистка антибиотического комплекса.

Полученные 3000 л культуральной жидкости (рН 7,8) подвергают центрифугированию для отделения мицели- альной массы и всплывающего слоя. ; Полученный осадок суспендируют в 1600 л метанола и смесь перемешивают в течение 2 ч. Нерастворимые вещества отфильтровывают, а метаноль- ный экстракт концентрируют в вакууме до 43 л. Всплывший слой, содержащий активные вещества, экстрагируют дважды 1000-литровыми порциями н-бу- танола. н-Бутанольные экстракты и концентрированньй метанольный экст ракт объединяют и упаривают азеотроп но с помощью периодического добавления воды к водному раствору (20 л получают маслянистое твердое вещество. Последнее дегидрируют в 30 л метанола, а нерастворимые вещества

442496

отфильтровывают. Метанольный экстракт, концентрируют в вакууме до 10 л, затем добавляют 40 л этилаце- f- тата и 30 л воды. Смесь перемешивают в течение 30 мин, органический спой отделяют, сушат над сульфатом натрия и упаривают в до 4 л. Концентрат вливают в 20 л н-гек- 10 сана, получают бледно-желтое твердое вещество - неочищенный комплекс ВВМ-1675 (90,14 г, активность 55 мкг/мг).

15 20 г комплекса растворяют в 20 мл метанола и наносят на колонку из се- фадекса КН-20 (размером 5,5x85 см). Колонку проявляют метанолом. Активные элюаты (контроль с помощью Sta20 phylococcus aureus 209Р) объединяют, концентрируют в вакууме и лиофи- лизируют. Получают 4,19 г полуочищенного комплекса. Далее проводят хроматографию на колонке из силикагеля

25 (5,0 X 50 см) с использованием хлороформа и метанола (с увеличением коли- чества последнего от 1 до 5% V/V) в качестве элюента. Элюенты объединяют с учетом антибактериальной ак30 тивности и тонкослойной хроматографии (тех)(кремнезем - CHCIj : 5:1 V/V) и концентрируют в вакууме. Получают почти гомогенный компонент А (выход после упаривания 351 мг),

35 элюируют 2%-ным метанолом в хлороформе, а затем элюируют смесь компонентов А, АЗ и Ai| (507 мг) с последующим элюированием смеси компонентов В (210 мг) 3%-ным метанолом в

40 хлроформе. Твердое вещество компонента А./ наносят на колонку из сефа- декса LH-20 (2,0 х 80 см), которую проявляют метанолом. Активные фракции концентрируют в вакууме досу45 ха и полученное твердое вещество кристаллизуют из метанола. Получают бесцветные пластины чистого компонента Af (124 мг). I

5Q Комплекс ВВМ-1675 f, А и А разделяют с помощью хроматографии на колонке из Бондарпак С, (ЗО х X 50 см). Элюирование проводят водным ацетонитрилом и биологически акgg тивные элюаты проверяют с помощью тех (силикагель в- обратной фазе - CHjCN : Н2.0 75:25 V/V). 33 мг А и I8 мг AJ элюируют последовательно 20%-ным ацетонитрилом (301 мг), а

затем элюируют компонент Aj, 50%-ным ацетонитрилом.

Твердое вещество, содержащее компоненты В и В, хроматографи- руют на колонке из силикагеля С3,0х X 40 см)с использованием хлороформа и 4%-ного метанола в качестве проявляющего растворителя. Активные фракции объединяют и упаривают. Получа- ют 7 мг компонента В . Компонент В элюируют 5%-кым метанолом в хлороформе, после уйаривания получают 8 мг компонента Ъ .

П р и м е р 3. Очистка компонен- та А.

Колонку Гленко (2,67 х 75 см) наполняют суспензией октадецил (C/g ) силикагеля Вейкер в связанной фазе (размер частиц 40 мкм) в.метаноле. Колонку подсоединяют в систему HPLC со средой под давлением и уравновешивают 1,5 л злюента (4-1,6% ацето- нитрила, 21,6% метанола, 36,8% 0,Ш ацетата аммония). 100,5 мг частично очищенного компонента А, полученного по примеру 2, растворяют в 2 мл ацетонитрила. Полученный образец пропускают через колонку. Колонку злюи- руют тем же элюентом и собирают 87 мл фракции. Элюент контролируют при 254 нм и 340 нм. Фракции 55-71 сливают и эктрагируют дважды по 1500 мл хлороформа. Хлороформ упаривают досуха, получают 89,8 мг остат- ка (С).

Колонку Гленко (1,5x20 см) заполняют суспензией 12 г силикагеля Woe 1т с размером частиц 60-200 мкм. Остаток (с) наносят на колонку в растворе хлороформа. Колонку элюируют 500 мл линейного градиента хлороформа до 10% метанола в хлороформе, собирают фракции по 20-25 мл. Фрак- ции 6-9 сливают и упаривают досуха, получают 73 мг остатка (D).

Колонку Гленко (1,5x20 см) наполняют суспензией 12 г силикагеля Woelm с размером частиц 63-200 мкм в Скеллизольве В. Остаток (О) растворяют в 2 мл хлороформа и наносят на колонку. Хлороформ заменяют 15 мл Скеллизольва В. Колонку элюируют 500 мл линейного градиента Скеллизолва В до 60% ацетона в Скеллизольве В собирают фракции по 26-25 мл. Фракции 19-23 сливают и упаривают досуха

IQ15

Получают 65,6 мг чистого компонента А .

Компонент А представляет собой кристаллы белого до бледно-желтого цвета. Температура плавления 156- 158 С (с разложением).

Элементарный анализ: С - 52,17%, Н - 6,15%; N - 4,63%; S - 9,09%, О - 27,96%.

Спектр УФ абсорбции (Вариан УФ, Сагу 219, растворитель - метанол, концентрация 0,01356 г/л):

Я макс. (нм) Абсорбционная

способность

12,4 плечо 25,1 25,5

Оптическое вращение (растворитель - СНС1з):Г, - 207 (С 0,0351);СЛГ - 191 (С 0,5, CHCl ) .

При тонкослойной хроматографии на силикагеле (система растворителей CHClj : CHjOH - 5:1 V/V) Ry 0,74; на силикагеле в обратной фазе (CHjCN : HjO - 75:25 V/V) Ry 0,18,

Основные полосы поглощения (КВг): 985,1015, 1070, 1110, 1150, 1210, 1250, 1308, 1380, 1405, 1446, 1520, 1592, 1608, 1668, 1715, 2920,2960, 3360, 3440 см . Мол.м. 1248.

Растворим в хлороформе, этилацег- тате, ацетоне, этаноле и метаноле; слабо растворим в бензоле и воде; нерастворим в н-гексане и четырех- хлористом углероде.

Дает положительную реакцию с хлорным железом, реактивами Эрлиха и Тол- лена; отрицательную реакцию в опытах Сакагучи. снингидрином и антроном.

Обладает антибактериальной активностью в отношении различных бактерий и грибов; индуцирует профаг в лизогенных бактериях; ингибирует рост лейкемии Р-388, лейкемии L-1210 меланомы В16 и легочной карциономы Льюиса (на мышах).

Очистка компонента А.

Колонку Гленко ( внутренний диаметр 2,65 см) наполняют суспензией октадецил (С« ) силикагеля Baker в

связанной фазе в метаноле (размер частиц 40 мкм}. Колонку присоединяют к системе HPLC со средним давлением и уравновешивают 1,5л элюента (50% ацетонитрила, 20% метанола, 30% 0,1М ацетата аммония). 76,9 мг частично очищенного компонента А2 ( полученного по примеру 2) растворяют в 2 мл ацетонитрила и готовят образец. Последний наносят на колонку, кото- Iрую элюируют тем же элюентом. Собирают 87 мл фракций 31-738, экстрагируют дважды по 500 мл хлороформа. Хлороформ упаривают досуха.. Получают 65,8 мг гомогенного компонента .

Компонент А имеет вид белых крис- .таллов; растворим в хлороформе, этил- ацетате, ацетоне, этаноле, метаноле; слабо растворим в бензоле и воде; не растворим в н-гексане и четы- реххлористом углероде. Дает положительную реакцию с хлорным железом (З), реактивами Эрлиха и Толлена; отрицательную реакцию в опытах Сака- гучи, с использованием нингидрина и антрона,

Точка плавления 147-149 С, Угол оптического вращенияСо() 179,4 (С 0,5,СНС1э) , мол,м. л, 1248.

Элементарньй состав: С 52,71%; Н 5,94%; N 3,94%; S 9,39%;ч О 28,01%.

125-127123-126

-161-176

С - 54,55%С-54,65%

Н - 6,46Н - 6,29%

И - 3,73И - 3,51%

S - 7,49S - 8,07%

О - 27,77%О - 27,48%

253(286)253(257)

0,71 (тех на силикагеле, система растворителей - хлороформ:метанол 5:1 V/V); R 0,21 (силикагель в об-- ратной фазе, ацетонитрил:вода - 75:25 V/V).

УФ абсорбция (метанол,€,02052 т/л);

Я макс, 320

282.

252

214

(нм) Абсорбционная способность 12,2

16,3

26,2 25,8

ИФ-спектр (КВг):.950, 1015, 1070, 1100, 1155, 1213, 1250, 1313, 1375, -1405,1450, 1520, 1595, 1610, , 1735, 2940, 2980, 3440 .

Обладает антимикробной активностью в отношении различных бактерий и грибов; индуцирует профаг в лизоген- ных бактериях; ингибирует рост лейкемии Р-388, лейкемии L-1210, мелано- мы В16, легочной карциноь1Ы Льюиса (на мьппах).

В таблице приведены физико-механические свойства.компонентов А,, А, By , Вг.

159-161

156-159

-171

-122

253(225) 248(212)

Все компоненты дают положительную реакцию с хлорным железом (З), с реактивами Эрлиха и Толлека и отрицательную реакцию - в опытах Сака- гучи, с нингидрином и антроном.

Обладают антимикробным дейс твием в отношении различных бактерий и грибов (стафилококков, микробактерий, эшерихий, клебсиелл, псевдомонад, различных видов Candida и др.). Индуцируют профаг в лизогенных бактериях, компоненты Aj и ингибируют рост лейкемии Р-388.

Следующим пример иллюстрирует способ получения антибиотического комплекса с помощью культуры Actino-, madura verrucosospora ЛТСС 39638.

П р и м е р А. Вегетативную среду, содержащую 2% растворимого крах мала, 1% глюкозы, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% NB-амина типа А и 0,1% карбоната кальция, рН до стериизации 7,0, засевают культурой штамма АТСС 39638. Посев инкубируют при 32 С в течение 4-х дней на вращаюемся встряхивателе (250 об/мин). Затем 5 мл полученной культуры переносят в колбу Эрленмейера объемом 500 мл со 100 мл ферментационной среды (3% тростниковой мелассы, 1 % кукурузного крахмала, 1% рыбной муки, 0,005% пентагидрата сульфата меди, 0,05% гептагидрата сульфата магния,

0,1% карбоната кальция, рН стерилизации 7,0) .

Ферментацию осуществляют при 28°С в течение 7 дней на вращающем

131344249

ся встряхивателе. Получают 1,5 мкг/ ванием 2%-ного метанола в бензоле, /мл антибиотического комплекса. Фракции, содержащие гомогенный комПример 5. Полученный по при- понент А , упаривают в вакууме досу- меру 4 ферментационный бульон (3000л ха. Полученное плотное вещество

рН 7,6} разделяют на мицелиальную лепешку и вспл()тший слой.

Мицелиальную лепешку экстрагируют 2000 л метанола в течение 1 ч и фильтруют.

Активные вещества, содержащиеся . во всплывшем слое, экстрагируют 1800 л н-бутанола.

Метанольный и н-бутанольный экстракты объединяют и концентрируют азеотропно при периодическом добавлении воды (20 л J к водному раствору, при этом осаждается маслянистое твердое вещество. Смесь встряхивают 3 раза с 20 л (на каждое встряхивание этилацетата. Экстракты объединяют, фильтруют и упаривают до 4 л. Концентрат смешивают с 30 л н-гексана при перемешивании и получают твердое вещество бледно-желтого цвета. (81,7г, активность 59 мкг/ /мг), Неочищенньй комплекс (20 г) растворяют в 20 мл метанола и нано- аят на колонку Сефадекса Н-20 (5,5х х85 см). Колонку проявляют метанолом, элюирование контролируют методом биологического анализа с использованием Staphylococcus aureus 209Р

Активные элюенты объединяют концентрируют в вакууме и лиофилизируют Получают 4,86 г комплекса, активност 203 мкг/мл. Полученное вещество хро- матографируют на колонке из силикаге- ля (3,0x70 см) с использованием хлороформа и увеличивающегося от 1 до 5% количества метанола в качестве проявителя. Элюаты проверяют на антибактериальную активность и методом ТСХ, затем обыединяют и концентриру- К)т в вакууме.

Концентрат элюируют 2%-ным метанолом в хлороформе, получая 425 мг (после выпаривания) компонента А с активностью 960 мкг/мл, а затем 732 мг смеси компонентов Aj, АЗ и А (активность 340 мкг/мг), с последующим элюированием 3%-ным метанолом в хлороформе комплекса компонентов В и Bj (200 мг, активность 190 мкг/ /мг) .

Полученный вьше компонент А повторно хроматографируют на колонке с силикагелем (2,2x44 см) с использо

кристаллизуют из 10 мл метанола. Получают бесцветные кристаллы компонента А (197 мг, активность 1000 мкг/мл).

Комплекс А2,-А и А (537 мг) разделяют с помощью хроматографии на колонке из Бендапак С, (2,0 х X 42 см). Элюируют водным ацетонитри- лом и биологически активные элюаты

проверяют с помощью ТСХ (Мерх, си- ликагель в обратной фазе - 75: 25 V/V).

0

0

0

Компоненты А (45 мг, активность 410 мкг/мг) и АЗ (19 мг, активность 300 мкг/мг) элюируют 20%-ным ацето- нитрштом, а затем 50%-ным ацетонит- рилом, Элюируют компонент А (203 мг). Фракции компонента А крис5 таллизуют из смеси хлороформ-н-гексан. В осадок вьшадают бесцветные палочки (70 мг, активность 290 мкг/мг) .

Плотное вещество, содержащее компоненты В и Вг, хроматографируют на колонке из силикагелп (3,0x40 см с использованием хлороформа и метанола в качестве элюирующего раствора. Активные фракции элюированные 4%- ным метанолом в хлороформе, объединяют и упаривают. Получают 7 мг чистого компонента В с активностью 180 мкг/мг. Компонент В элюируют 5%-ным метанолом в хлороформе и после упаривания получают 8 мг компонента В. с активностью 140 мкг/мг.

Использование предлагаемых способа и штаммов-продуцентов позволяет получать группу новых антибиотиков , обладающих широким антимикробg ным спектром, индуцирующих профаг в лизогенньгх бактериях и обладающих противоопухолевым действием в отношении лейкемии, меланомы, легочной карциномы,Льюиса.

50

Формула изобретения

1. Способ получения компонентов А ,А2,Аз ,Ai, ,В или Bj. антибиоти- ческого:комплекса ВВМ-1675, обладающих антимикробным и противоопухолевым действием заключающийся в том, что штамм Actinomadura verrucosospo- га АТСС 39334 или штамм Actinomadura

151

verrucosospora АТСС 39638 культивируют в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях, в течение от 68 ч до 7 дней при скорости аэрации от 0,667 до 1,2 л воздуха/мин/л ферментационной среды, далее отделяют мицелий от ферментационной жидкости, экстрагируют, порознь органическими растворителями, экстракты объе- диняют, концентрируют, полученный полуочищенный комплекс разделяют методом хроматографии, элюируют компо

4А24916

ненты комплекса органическими растворителями и очищают целевые продукты.

I

2. Штамм актиномицета Actinomadu- га verrucosospora АТСС 3933Д и штамм актиномицета Actlnomadura verrucosospora АТСС S9638 (American Type Cul- 10 ture col lection),используемый для получения компонентов А ,A2,Aj,A4, В, или Bj антибиологического комп-, лекса ВВМ-1675, обладающих антимикробным и противоопухолевым действи- 15 ем.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения антибиотического комплекса ВВМ-1675 и его компонентов А.А, Aj , А , By и В , а также новых штаммов-продуцентов антибиотиков Actinomadura verrucoso- spora АТСС 39334 и его мутанта АТСС 39638. Цель изобретения - изыскание новых штаммов-продуцентов и разработка способа получения антибиотиков, обладающих антимикробным и противоопухолевым действием. Штамм АТСС .39334 вьщелен из пробы почвы Аргентины, а гатамм АТСС 39638 является его мутантом. Антибиотический комплекс получают путем культивирования одного из упомянутых штаммов в ферментационной среде, содержащей тростниковую мелассу, кукурузный крахмал, рыбную муку и минеральные соли, в течение 3-7 дней при 28 С в условиях встряхивания и перемешивания при аэрации со скоростью от 0,667 до 1,2л воздуха на 1 л ферментационной среды в 1 мин. Целевой продукт экстрагируют из мицелиальной лепешки и всплывающего слоя органическими растворителями. Экстракты объединяют, концентрируют и полуочшценный комплекс подвергают хроматографичес- кому разделению для получения компонентов AY jAj. ,АЗ jA , В и B;j-. Компоненты элюируют в градиенте метанола в хлороформе, активные фракции каждого компонента объединяют, концентрируют, перекристаллизовьшают и выделяют чистые продукты. Антибиотики обладают широким антимикробным действием, индуцируют профаг в ли- зогенных бактериях, антибиотические компоненты группы А обладают противоопухолевой активностью, ин- гибируя рост лейкемии, меланомы, легочной карциномы Льюиса. 2 с.п. ф-лы, 1 табл. § (У) см