Штамм @ @ 12/3а-продуцент аклациномицинов @ и @ Советский патент 1984 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/56 

Од 00

со f Р1зобретение относится к микробио логической промышленности, в частно ти к производству противоопухолевых антибиотиков аклациномицинов А и В. Известен штамм Streptomyces galilaeus MA 1А4М1-продуцент аклац номицинов А и В l 2. Однако известный штамм не облада ет высокой активностью антибиотикообразования 46 мг/л аклациномици на А -и 23 мг/л аклациномицина, В . Целью изобретения является повышение активности антибиотикообразованйя. Эта цель достигается с помощью штамма Streptomyces lavendofolial 12/ЗА. из почвенного обра Штамм вьщелен да Средней Азии. Депонирован в коллекции культур ВНИИА под № 1670. Штамм Str.lavendofolial 12/ЗА ха рактеризуется следующими признаками. Культурально-морфологические при знаки. Образует обильный воздушный мице лий сиреневато-розового цвета. Спороносцы. спиральные, споры с гладкой поверхностью размером 0,7{Х)-1,4 мк Субстратный мицелий от бежево-розов го до грязно-лилового цвета. В среду выделяется пигмент буро-коричневого до буро-розово-фиолетового. . Выращивание культуры проводили при 28°С в течение 28 дней, Агар Чапека. Воздушный мицелий - хорошо разви сиреневато-розовый. Субстратный мицелий - бежево-роз вато-лиловый. Растворимый пигмент буро-розоватый. Агар Гаузе 1. Воздушный мицелий - рост обильный, бледно-розоватый. Субстратный мицелий - буро-грязио-фиолетовый. Растворимый пигмент буро-розоватый. Среда 1 КрасильНИКОВа. Субстратный мицелий - бежево-гря но-фиолетовый. Растворимый пигмент буро-розово-фиолетовый. Крахмальный агар.Воздушный мицелий - рост умеренный, розовый. Субстратный мицелий бежево-розовый. Растворимый пигмент бежеворозовый.. Глюко3оаспарагиновый. 3 Субстратный мицелий - песочно-буроватый до коричневого. Растворимый пигмент песочно-коричневый. Агар Ваксмана. Воздушный мицелий - рост обильный, розово-серый. Субстратный мицелий - от буро-каштанового-коричневого до грязно-фиолетового ). Растворимый пигмент коричнево-бурый /В2/. Агар дрожжевой с растворимым крахмалом . Воздушный мицелий - рост обильный, розово-серый. Субстратный мицелий - коричневый. Растворимый пигмент - песочно-бурый до коричневого. Агар глюкозодрожжевой. Воздушный мицелий - рост обильный, белесый. Субстратный мицелий - темно-коричневый. Растворимый пигмент коричневый. Овсяный агар. Воздушный мицелий - рост хороший, розово-серый. Субстратный мицелий - буро-коричневый /В2/. Растворимый пигмент светло-коричневый /В7/. Агар солодовый. Воздушный мицелий - рост обильный, розово-серый. Субстратный мицелий - коричневокаштановый. Растворимый пигмент буро-коричневый. Агар Гаузе 2. Воздушный мицелий - рост удовлетворительный, светло-серый , Субстратный мицелий - коричневый. Растворимый пигмент - кор1тчневый. Воздушный мицелий - рост слабый. Субстрат мицелий - бежево-песочный. Растворимый пигмент отсутствует. Агар с тирозином. Воздушный мицелий - рост обильный, сиренево-розовьщ. Субстратный мицелий - сливяно-черный. Растворимый пигмент-умбровый. Агар Треснера с лимонно-кислым железом. Воздушньй мицелий - рост хороший, сиренево-розовый. Субстратный мицелий - темноумбровЬш. Растворимый пигмент темноумбровьй. . Ломтики картофеля.

Воздушный мицелий - рост хороший, от белого до розового.

Субстратный мицелий - бурый. Растворимый пигмент бурый.

Физиологические признаки.

Аэроб, оптимум роста 24-30С. При не растет. Желатину разжижает умеренно, молоко пептонизирует с побурением, крахмал гидролизу ет умеренно. Меланоиды образует (среда Треснера с лимоннокислым железом, агар с тирозином |.

Культура Str.lavendofolral штамм I 2/ЗА хорошо использует следующие источники углерода: D -глюкозу, О-ксилозу, су -арабинозу, D-фруктозу, D-галактозу, 17-инозит . Слабо использует или не использует с -рамнозу, не использует сахарозу, раффинозу и D-маннит.

Культура Str.lavendofolial штамм 12/3-А сохраняется на скошенных агаризованных средах под слоем вазелинового масла при +5°С в течение 6 месяцев.

Антагонистргческие признаки.

Культура Str.lavendofolial штамм 12/3-А при культивировании в жидкой питательной среде в колбах на качалках на третьи сутки образует аклациномицин А в количестве 56-60 мг/л. который обладает антимикробньпм действием. Данные по антимикробной активности приведены в таблице.

Антимикробный спектр аклациномицина А, выделенного из культуры Str.lavendofolial штамм 12/3-А, в сравнении с прототипом.

250,0 250,0

aerugenosa

Штамм Streptcimyces lavendofolial 12/ЗА, № 1670 (Коллекция культур мик- роорганизмов ВНИИА) - продуцент аклациномицинов А и В.

15,56 7,8

15,5615,56

г чувствительность определяли методом двухкратных серийных разведений в мясо-пептонном агаре рН 7,0 при микробной нагрузке 10 кл/мл с помощью штамма-репликатора через 20 ч инкубации при 37°С,.

Аклациномицин А обладает также цитотоксической активностью и противоопухолевым действием.

. Биохимические свойства.

Молоко пептонизирует с побурением крахмал гидролизует умеренно. Желатину разжижает умеренно. Усваивает 1 /В-глюкозу, D-ксшшзу, L-арабинозу р-галактозу, 3-инозит; не усваивает сахарозу, L-рамнозу, Р-фруктоз-у, раффинозу, р-маннит. Меланоиды образует. Пример I. Споровый материал культуры Str.lavendofolial штамм 12/3-А вьфащивают на овсяном агаре при 28 °С в течение 12 дней до появления обильного .воздушного мицелия. Для получения маточного посевного агаровый блок засевают в колбы Эрлен мейера емкостью 750 мп в жидкую сре. ду В-Й без сернокислой меди и пенога сителя. Выращивание проводят на качалке (250 об/мин ) в течение 2 суток при . В посевной инокулятор (Ю вносится маточная культура в количестве 5%. Выращивание проводят на среде В-2 без сернокислой меди при 28°С 200 об/мин и аэрации 10 л/мин в течение 24 ч. Вегетативный инокулят используют в количестве 5% от объема ферментационной среды, Биосинтез проводят в 100 л фермен тере, содержащем 60 л среды В-2, в течение 3 суток при температуре 27°С, 200 об/мин и аэрации 60 л/мин Содержание аклациномицина А и ак, ч лациномицина В в ферментационной жидкости определяют по следующей методике: 1. Определение аклациномицина А и аклациномицина В в мицелии. После окончания ферментации получают мицелий из 5,0 мп, культуральной жидкости центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин. Из полученного мицелия антибиотики экстра гируют в течение 2 ч 4,0 мл ацетона при перемешивании через 15-20 мин. Из 1,0 МП экстракта вьшаривают ацетон в вакууме при температуре ниже и проводят реэкстракцию 1,0 хлс роформа. Сконцентрированный хлороформньй экстракт используют для хром тографического разделения антибиотического комплекса. С этой целью на пластинку с незакрепленным слЬем сорбента.капилляромj отступив слева и от нижнего края пластинки 2 см, наносят весь хлороформный экстракт в виде линии, длиною 1-1,5 см. На эт же пластинку наносят раствор стандартного образца аклациномицина А и раствор аклациномицина В. Пластинку помещают в хроматографическую каме36ру, содержащ то хлороформ-этилацетатметанол - 7 ; 2 . 1 . Когда фронт растворителя достигает края пластинки, ее вынимают и подсушивают на воздухе 20 мин. Желтые зоны, соответствующие по подвижности аклациномицину А и аклациномицину В, элюируют раздельно 4 мп метанола при рН 6 для спектрофотометрии на волне 430 нм. Количество аклациномицинов А и В определяют исходя из удельной экстинкции антибиотиков ( Е для аклациномицинов А и В равна 158,6 и 159,2 соответственно jв мг на 1 л культуральной жидкости по формуле: для аклациномицина А С., 202Д для аклациномицина В С , МГ/А 2. Определение аклациномицина А и аклациномицина В в нативном растворе . Нативный раствор получают центрифугированием из 5,0 мл культуральной жидкости. Экстрагирование проводят этилацетатом при из расчета на 5 МП нативного раствора 5 мл этилацетата. Этилацетатный экстракт в количестве 2 мл выпарив,ают в вакууме, реэкстрагирование прово„„„ , ,,„ „„ , „ дд хлороформа. Дальнейшие процедуры такие же, как в случае определения аклациномицинов А и В в мицелии. t Количество аклациномицинов А и В определяют, исходя из удельной экстинкции антибиотиков по формуле: для аклациномицина АС(мг/л ) 126,6Д для аклациномицина ВС(мг/л1 126,ОД На 3 сутки ферментации на среде В-2 культура 12/3-А образует около 56 мг/л аклациномицина А и 4-8 мг/л аклациномицина В. Для выделения аклациномицина А и аклациномицина В культуральную жидкость (60 л ) фильтруют на нутчфильтре при рН 4,5-5,0. Из нативного раствора антибиотики экстрагируют зтилацетатом в соотношении 10:1. Органический слой отделяют и выпаривают до.водного остатка в вакууме циркуляционного испарителя при температуре не выше 40°С. Влажный мицелий (5 кг) дважды экстрагируют ацетоном порциями по 10 л. Мицелий отделяют фильтрованием и отбрасы-х вают. Ацетоновые экстракты объединяют и выпаривают. Водные остатки, полученные после отгонки этипацетата и ацетона, объединяют и из полученного концентрата (5 л/ после подщелачивания 10%-ным NaOH до ,8, антибиотики экстрагируют трижды двоиным объемом толуола {10x3 л|, Толуольные вытяжки объединяют, а водный остаток отбрасывают, Толуольный экстракт (30 л) упаривают в вакууме при температуре не выше 40°С до 0,1 исходного объема (3,0 л). Из полученного концентрата антибиотики экстрагируют 0,5-кратным объемом 0,01 н.НС Образовавшуюся при экстракции эмульсию разбивают центрифугированием или сепарированием. Антибиотики из водного раствора экстрагируют 0,5-кратньгм объемом хлороформа. Время экстракции - 20-30 мин при постоянном перемешивании. Образующуюся эмульсию разбивают на сепараторе. Водный слой отбрасывают, слой хлороформа (1,5 л сушат 4 ч - над безводным Na2S04 из расчета 0 г соли на 100 мл экстракта. Хлороформный экстракт отделя фильтрованием от сульфата натрия и упаривают в вакууме на роторном испарителе до О,1 объема, к остатку добавляют 10-12 объемов сухого гексана и для завершения процесса осаждения смесь оставляют на 30.мин Выпавший в осадок антибиотик отделяют фильтрованием на воронке Бюх нера с пористым стеклянным фильтром № 4 и подсушивают. Фильтрат упа ривают досуха на роторном испарителе при температуре не вьщ1е 40с. остаток р стируют гексаном, гексан отделяют от осадка фильтрованием. Оба осадка объединяют и передают на хроматографическую очистку. Полу чают 2,5 г препарат-сырца. Хроматографическре разделение аклациномицинов. Колонку (8x95 см) заполняют 5,5 суспензии, состоящей из 1,8 кг водной кремниевой кислоты (250-400 мкм и 5,5 л хлороформа, в котором предварительно растворяют 0,5%-ный триэтнг|амин в уксусной кислоте. По.сле заполнения колонки суспензией ее промывают 3 л хлороформа.. На колонк наслаивают препарат-сырец (10 г), полученный на предыдущей стадии и растворенный в 100 мп хлороформа. П ре сорбции антибиотиков колонку подключают к системе для-элюации. Для разделения антибиотиков проводя 0 38 ступенчатое градиентное элюйрование. С этой целью через колонку пропу ск ают: 1 4л четырехзшористого углерода;2) 8л системы, состоящей из четыреххлористого углерода (СС1 и изопропанола 25:1; 3) 8,5 л системы, состоящей из ССЦ-изопропанола 20:1; 4) 20,5 л системы, состоящей из СС14-изопропанола 10:1 . Аклациномицин В снимается с ко.лонки системой СС14 изопропанол 20:1, а аклациномицин А - ССЦ- изопр-опанол 10:1. Элюаты по 5-7-л, содержащие аклациномицин А и аклациномицин В, раздельно экстрагируют 0,2кратным объемом 0,01 н, раствором HCI. Из водного слоя антибиотики экстрагируют 0,2-кратным объемом хлороформа. Хлороформные экстракты аклациномицина А и аклациномиЦИ з В сушат раздельно безводным Na2SO из расчета 2 г на 100 мл , раствора, осушитель отделяют фильтрованием, а фильтрат упаривают в вакууме при 40°С до О,1 объема. К этому остатку добавляют 10-кратный объем сухого гексана. Смесь выдерживают ЗО мин, осадок отделяют на пористом стеклянном фильтре № 4 и сушат до воздушно-сухого состояния.. Получают 0,7 г аклациномицина А и 0,1 г аклациномицина В из 2,5 г препарата-сырца. Пример 2. Агаровым блоком 12 суточной культуры Str.lavendofolial штамма 12/3-А, выращенной на овсяном агаре, засевают посевные колбы со средой В-2 без сернокислой меди. Выращивание проводят на качалке при 250 об/мин при 28 С в течение 48 ч. .Выросший посевной материал используют в количестве 5-10% от объема ферментационной среды. Ферментацию проводят в колбах Эрленмейера на среде В-3 следующего состава, %: соевая мука 1,5, крахмал картефельный 3, мел 1,4, натрий хлористый 0,3, сернокислая медь 0,007. Колбы с ферментационной средой культивируют в тех же условиях в течеjjjjg 72 ч. Активность культурапьной жидкости при этом составляют 60 мг/л для аклацииомицина А и 10 мг/л для аклациномицина В.

91069433

Использование изобретения позво- циномицина В (с 23 мкг/мл до лит повысить активность антибио- мкг/мл; упростить способ по- тикообразования аклациномицьна А; лучения и очистки целевого пропонизить степень образования акла- дукта.