Способ дифференциации вирулентных и вакцинных штаммов вируса гриппа Советский патент 1984 года по МПК C12N7/00 C12Q1/70 

tsD

О

СО т- Изобретение относится к области медицины, а именйо к определению в 1рулёнтн6сти вируса гриппаV Известен способ дифференциации вирулентных и вакцинных штаммов вируса гриппа путем заражения вирусом гриппа клеток с по.следующйм инкубированием и гистологическим исследованием зараженных клеток HlJ. Однако при известном способе зараженные вирусом гриппа клетки в сЕГёднем культивируют в течение 7 дн для получения необходимого ответа. ЦелБЮ йзббретения является ускор зние способа. Эта цель достигается тем, что для Заражения используют лейкоциты пёриферичёск:ой крови человека, виру вносят из расчета 1000 ВИДу на клётку; и гистологические, исследовайия проводят через 5, 15, 30 мин до 48 ч инкубирования. В йсслёйованйях используют йтам.мы вирусагриппа А(Н Н2} - в1даеленные от больных гриппом в перн&д эпи дёмии в 1976-1977 г.г. (2-3 пасаж на куриных эмбрионах) и вакцинный в Иру С А (в ик тори я 35)72,- 1йГейШ ьз у е мйй для приготовления живой гриппоз ной sakiiiiffla, / ; Длянакопления вйруссодержаадей аллантоиснрй жидкости испытуемым штаммом isйруса зара а:к1Т 10-И-дневнкгё куринвае эмбрионы, которые вскры вают через 48-72 ч. Сорбцией - элюцйей на куриных эритроцитах получают очищенную и концентрированную 1в;эвесь виру са. Элюцию осуй ествляют -либо в 0,11 м фосфатном буфере, либо среде 199. К элюату добавЛяют че ловеческий альЬумйн до конечной кон центрации 1%. . - . Титрованием на 10-11-дневных кур ных эмбрионах определяют инфекционный, титр элюата. в период проверки йнфёкЦйонного титра, элюат хранят . при 4°С. , ; . ,., . -- . ЛеЙ кЬцйт1Ы перйферич.ескрй kpoBij e-jfcs t ;ffeH6cpeS7c B лёМия заражают i()OQ .испытуемого вируса.Через 5 мим посл добавления вируса одйу треть вэвесй клеток посйе тщательного пЖрёмёшйванйя центрифугируют 8-10 мин при 1000 об/мин, осадок кЛеток фиксируют и заливают в эпоновые смолы. Оставшуюся взвесь лейкоцитов продолжают культивировать в течение 1 ч при 36°С, затем центрифугируют 8-10 мин при -1000 об/мин, надосадок удаляют, а к осадку добавляют среду 199 с 1%-ным а.льбумином человека (концентрация клеток в Культивируемой смеси 1 ) ипомещают в термостат при Зб°С.. Подойину взвеси клеток после тщательного пипетирования. фиксируют и заливают в эпоновые смолы через 7ч, а оставшуюся - через 24 ч.. Готовят ультратонкие срезы и изучают их в электронном микроскопе. На ультратонких срезах клеток, зафиксированных через 5 мин после заражения, определяют большое .количество внутри- и внеклеточного вируса, независимо о.т вирулентности испытуемого штамма. В этот срок исследоваййя различия между вирулентным и вакцинным штаммомвыражаются в более активной адсорбции вирионов вакцинного штамма на эритроцитах, которйё в небольшом количестве присутствуют во взвеси лейкоцитов. Четкие различия между вирулентным и вакцинньам штаммайи выявляются при изучении ультратрнких срезов лейкоцитов, зафиксированных через7 ч после заражения, Вирионы вирулентного штамма йе разрушаются нейтрофилами, внутри- и внеклеточно обнаруживают многочисленные малоизмененные вируснйе .частй1зсы.. В противоположность этому количество внутри и внеклеточнБ Х вирионов вакцинного штамма спустя 7 ч резко уменьшается иЛИШЬ в единичных нейтрофилах выявляют 2-3 интактные вирусные частицы. Через 24 ч внеклеточно -выявляют большое число вирионов лишь при заражении клеток вирулентнвми штаммами вируса гриппа вирионы -й акцинного в этот период, как правило, не обнаруживаются. Предлагаемый спрсоб прзволяет отчетливо дифференцировать вирулентный и ва цинньйштамм вируса гриппа через 24 ч (вместо 7 дней изйестньам способом)

СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВИРУЛЕНТНЫХ :и ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ. ВИРУСА ГРИППА путем заражения вирусом гриппа клеток с последующим инкубированием и гистологическим исследованием зараженных клеток, о т л и ч а ю 1Д и и с я тем, что,с целью ускоре-. НИН способа, для заражения используют лейкоциты периферической,крови человёка, вирус вносят из расчета 1000 ЕИДдо на клетку и гистологические исследования проводят через 5, 15, 30 мин до 48 ч инкубирования.