СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВИРУСВАКЦИНЫ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ МАРЕКА Российский патент 2003 года по МПК A61K39/255 C12N7/00 A61P31/12 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики болезни Марека.

Болезнь Марека (БМ) - высококонтагиозное, лимфопролиферативное, злокачественное, вирусное заболевание птиц. БМ регистрируется во всех странах мира, где развито промышленное птицеводство, в том числе и в нашей стране, вызывая большие экономические потери. БМ характеризуется образованием единичных (в начальной стадии) и множественных опухолей во внутренних органах, коже, мышцах, а также изменениями центральной и периферической нервной системы. Вирус болезни Марека (ВБМ) повреждает иммунокомпетентные органы (селезенку, тимус, клоакальную сумку) и обладает, таким образом, иммунодепрессивной активностью, что приводит к снижению общей резистентности птиц и повышению их чувствительности к другим болезням. В связи с этим БМ довольно часто протекает в ассоциации с другими заболеваниями. Важным средством предупреждения БМ и снижения потерь от заболевания является вакцинопрофилактика. Для специфической профилактики используют вакцины трех типов: из аттенуированных штаммов ВБМ (серотип 1), из природноослабленного непатогенного ВБМ (серотип 2) и из штаммов вируса герпеса индеек (серотип 3). Основой профилактики БМ является активная иммунизация цыплят в суточном возрасте живыми моно-, би- или поливалентными вакцинами. Большинство известных в мире профилактических препаратов созданы на основе штамма FC-126 вируса герпеса индеек (ВГИ) или его комбинаций с природно известными представителями I и II серотипов ВБМ и надежно защищает привитое поголовье от полевых штаммов ВБМ средней степени патогенности (1, 2, 3, 4). Однако с появлением в последнее время в птицехозяйствах особовирулентных штаммов ВБМ участились случаи констатации не всегда достаточной их эффективности. Поэтому во многих странах все более широкое распространение получают препараты на основе природно апатогенного штамма CVI 988 (1 серотип), которые по мнению многих авторов, способны противостоять действию особовирулентных штаммов ВБМ и надежно защищать привитое поголовье (1, 5). Однако проблема усовершенствоания технологии изготовления используемых вакцинных препаратов на предмет повышения их иммуногенной активности и безвредности остается актуальной.

Известен способ изготовления вирусвакцины против БМ, включающий инфицирование культуры клеток ФЭК штаммом Mdll(75c)R2 ВБМ 1 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, добавление криопротектора и получение целевого продукта (6).

Известен способ изготовления вирусвакцины против БМ, включающий инфицирование культуры клеток RIG-2 радужной форели штаммом CVI 988 ВБМ 1 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, добавление криопроектора и получение целевого продукта (7).

Известен способ изготовления вирусвакцины против БМ, включающий инфицирование культуры клеток ФЭК штаммом Md II/75/R2 ВБМ 1 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, добавление криопротектора и получение целевого продукта (8).

Известен способ изготовления вирусвакцины против БМ, включающий инфицирование культуры клеток ФЭК ВБМ 1 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, добавление криопротектора и получение целевого продукта (9).

Известен способ изготовления вирусвакцины против БМ, включающий инфицирование культуры клеток ФЭК ВБМ 1 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, добавление криопротектора и получение целевого продукта (10).

Известен способ изготовления вирусвакцины против БМ, включающий инфицирование культуры клеток QT35 перепела штаммом MVD 1 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, добавление криопротектора и получение целевого продукта (11).

Основные недостатки известных способов состоят в том, что изготовленные в соответствии с ними вирусвакцины обладают узким антигенным спектром действия, низкой биологической и иммуногенной активностью и не обеспечивают удовлетворительной защиты против ВБМ, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ изготовления вирусвакцины против БМ, включающий инфицирование культуры клеток ФЭК штаммом CVI 988 ВБМ 1 серотипа, сбор вируссодержащей клеточной массы, добавление криопротектора и получение целевого продукта (12).

Недостаток способа-прототипа состоит в том, что полученная при его осуществлении вакцина не устраняет носительства вирулентного вируса, сохраняет умеренную вирулентность для высокочувствительных линий цыплят, а используемый для ее изготовления штамм отличается нестабильностью.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка способа изготовления вирусвакцины против БМ на основе нового штамма ВБМ 1 серотипа, обладающей более высокой иммуногенной активностью и стабильностью.

Указанный технический результат достигнут созданием способа изготовления вирусвакцины против БМ, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:
1. Способ изготовления вирусвакцины против БМ.

2. Инфицирование культуры клеток штаммом ВБМ 1 серотипа.

3. В качестве клеточного субстрата используют культуру клеток ФЭК.

4. Из штаммов 1 серотипа используют штамм 3004/ 109 ВБМ в эффективном количестве.

5. Инкубирование зараженной культуры.

6. Сбор вируссодержащей клеточной массы.

7. Добавление криопротектора.

8. В качестве криопротектора используют ДМСО.

9. В суспензию клеток ФЭК, инфицированных штаммом 3004/ 109 ВБМ, добавляют сыворотку крови КРС и ДМСО в соотношении 12:16-3:5-1:3 соответственно.

10. Получение целевого продукта.

11. Получают целевой продукт с содержание штамма 3004/ 109 ВБМ с биологической активностью не ниже 5,5•10⁵ ФОЕ/см³.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1. Способ изготовления вирусвакцины против БМ.

2. Инфицирование культуры клеток штаммом 3004/ 109 ВБМ 1 серотипа.

3. Инкубирование зараженной культуры.

4. Сбор вируссодержащей массы.

5. Добавление криопротектора.

6. Получение целевого продукта.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Инфицируют культуру клеток ФЭК.

2. Получают целевой продукт с содержанием штамма 3004/ 109 ВБМ с биологической активностью не ниже 5,5•10⁵ ФОЕ/см³.

3. В качестве криопротектора используют ДМСО.

4. В суспензию клеток ФЭК, инфицированных штаммом 3004/ 109 ВБМ, добавляют сыворотку крови КРС и ДМСО в соотношении 12:16-3:5-1:3 соответственно.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. Способ изготовления вирусвакцины против БМ.

2. Инфицирование культуры клеток штаммом ВБМ 1 серотипа.

3. Инкубирование зараженной культуры.

4. Сбор вируссодержащей клеточной массы.

5. Добавление криопротектора.

6. Получение целевого продукта.

По сравнению со способом-прототипом существенным отличительным признаком изобретения является использование при изготовлении вирусвакцины против БМ нового штамма 3004/ 109 ВБМ 1 серотипа в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Инфицируют культуру клеток ФЭК.

2. Получают целевой продукт с содержанием штамма 3004/ 109 ВБМ с биологической активностью не ниже 5,5•10⁵ ФОЕ/см³.

3. В суспензию клеток ФЭК, инфицированных штаммом 3004/ 109 ВБМ, добавляют сыворотку крови КРС и ДМСО берут в соотношении 12:16-3:5-1:3 соответственно.

Вирусвакцина, полученная предлагаемым способом, обладает более высокой иммуногенной активностью и стабильностью по сравнению с аналогичным препаратом, полученным способом-прототипом.

Достижения технического результата от использования предлагаемого способа объясняются тем, что при изготовлении вирусвакцины используют новый штамм 3004/ 109 ВБМ, обладающий по сравнению со штаммом CVI988 ВБМ более высокой иммуногенной активностью и стабильностью.

Исходный вирус для получения штамма 3004/ 109 был выделен в 1998 году из эпителия перьевых фолликулов SPF-цыплят, иммунизированных вируссодержащим материалом из штамма CVI 988 ВБМ.

Производственный штамм 3004/ 109 ВБМ получен путем последовательного пассирования в культуре клеток ФЭК. Штамм 3004/ 109 ВБМ представляет собой апатогенный генетически однородный вирусный материал, легко культивируемый в культуре куриных эмбриональных фибробластов с высокой биологической активностью (титр вируса 3,6•10⁶ФОЕ/см³) и вызывающий напряженный иммунитет по сравнению со штаммом CVI 988 у привитой птицы.

Штамм 3004/ 109 ВБМ депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 30 ноября 1998 года под регистрационным 3004/ 109-ДЕП.

По сравнению со штаммом CVI 988 штамм 3004/ 109 обладает более высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и стабильностью в нативном виде. Экспериментально подтверждена его возможность использования для приготовления вирусвакцины против БМ. Штамм 3004/ 109 ВБМ обеспечивает получение вирусвакцины против БМ, создающей защиту птиц против указанного возбудителя заболевания.

Штамм 3004/ 109 ВБМ характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки
Штамм 3004/ 109 ВБМ относится к семейству Herpesviridae, роду Herpesvirus, серотипу 1. На основании сравнительного электронно-микроскопического изучения производственного штамма CVI 988 и штамма 3004/ 109 при репродукции их в культурах клеток установлена идентичность морфологических характеристик обоих штаммов. Эти вирусы проходили онтогенетический цикл развития в нуклеоплазме, а в цитоплазме - завершающие стадии морфогенеза. Внутриядерный цикл развития включает стадии виропласта, нуклеоида, сборку нуклеокапсида, формирование наружной суперкапсидной мембраны. Наиболее частой формой, присутствующей на всех стадиях культивирования, является нуклеокапсид с нуклеоидом, представленным плотным образованием, заключенным в капсидную белковую оболочку. При электронно-микроскопическом исследовании штамм 3004/ 109 представлен типичными для ВБМ вирионами, имеющими кубический тип симметрии и форму икосаэдра. Вирус обладает полиморфизмом, может быть с оболочкой и без нее. В ядре пораженной клетки вирион имеет величину 90-100 нм, в цитоплазме его размер увеличивается за счет белковой оболочки до 180-200 нм. Оболочка состоит из 162 капсидов, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм 3004/ 109 ВБМ относится к 1 серотипу. При введении в организм вызывает латентно протекающую вирусемию. Антитела к данному вирусу обнаруживают в крови цыплят к 14-21 - дневному сроку с дальнейшим нарастанием к 40-60 дню. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РДП и ИФА. Активность в РСК не установлена. Концентрированный антиген 3004/ 109 реагирует в РДП со специфическими сыворотками ВГИ и ВБМ. Выявляются общие антигены с ВБМ в прямой и непрямой РИФ. При разрушении клетки вступает в реакцию с антителами к ВГИ и ВБМ в РН. В ИФА вступает в реакцию с антителами к ВГИ и ВБМ. В РЗГА и РГА эритроциты не агглютинирует.

Биотехнологические характеристики
Штамм 3004/ 109 активно размножается в культуре клеток ФЭК. Культивирование фибробластов проводят по общепринятым методикам с использованием смеси сред на основе ГЛА, Игла и 199, взятых в равных частях, с добавлением 10% эмбриональной сыворотки КРС. Клетки фибробластов выращивают во флаконах емкостью 50 см³ и 100 см³ (Повицкого), в матрасах емкостью 1,5 дм³ и в роллерных 3-литровых сосудах. Посевная концентрация клеток составляет 0,6-0,7 млн/см³ для 50 см³ флаконов и 1,2-1,5 млн /см³ для 3-литровых роллерных сосудов. При размножении в монослое куриных фибробластов вирус проявляет ярко выраженные цитопатические изменения в виде однородных фокусов размером 2,0-2,5 мм. При проведении последовательных пассажей в культуре ФЭК инфекционный титр вируса увеличивался и достигал 3,5•10⁶ ФОЕ/см. Штамм не патогенен для эмбрионов кур. У эмбрионов, инфицированных штаммом 3004/ 109, при вскрытии отмечали слабовыраженный гепатит, на ХАО - бляшки серовато-белого цвета звездчатой формы размером 0,5-1,0 мм в количестве 30-50 штук. Штамм 3004/ 109 ВБМ предназначен для использования в качестве сырья при изготовлении вирусвакцины против БМ.

Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм 3004/ 109 является ДНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 108-120•10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена двуцепочечной линейной молекулой. Содержание G+С - 46%. Вирион состоит из нуклеоида, икосаэдрического капсида, ассиметрично расположенного вокруг капсида электронноплотного материала, обозначенного как тегумент, и липопротеидной оболочки. Вирионная ДНК участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники в свою очередь расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Основными антигенными белками являются гликопротеины А (gА) и В(gВ). Гликопротеин В играет важную роль в индукции защитного иммунитета и является высококонсервативным среди герпесвирусов. Он представляет собой комплекс трех гликопротеинов: gр49, gр60 и gр100.

С помощью полимеразно-цепной реакции с использованием праймеров, комплементарных консервативному гену gВ, кодирующему гликопротеин В, был проведен анализ нуклеотидной последовательности штамма 3004/ 109 ВБМ.

Контролями служили: эпителий перьевых фолликулов, собранный от цыплят, зараженных штаммом "Конкур" вирулентного ВБМ, относящегося к 1 серологической группе; штамм SB1, относящийся к 2 серогруппе и образцы вакцины из штамма FS-126 (3 серогруппа). Для детекции были расчитаны универсальные для всех типов вируса праймеры МИ, которые фланкируют фрагмент гена gВ размером 450 нуклеотидов. Для типирования использовали внутренние типоспецифические праймеры М, MS и МГ, которые комплементарны геномам ВБМ 1, 2 и 3 серотипа соответственно. Результаты ПЦР показали наличие специфических ампликанов с праймерами М (421 н.), что подтверждало принадлежность генома штамма 3004/ 109 к 1 серотипу ВБМ. При этом праймер MS (386 н.) взаимодействовал с геномом ВБМ 2 серотипа, а спраймером MF (380 н.) с геномом ВГИ 3 серотипа, что свидетельствовало о методически правильно проведенном опыте и показало высокую специфичность и чувствительность полимеразной цепной реакции применительно к моделям вирусов БМ и ГИ.

Устойчивость к внешним факторам
Устойчивость штамма 3004/ 109 ВБМ к физическим и химическим факторам характеризуется следующими данными. Центрифугирование при 50 000 g осаждает вирус в течение 1 часа. В пределах рН 4-10 вирус чувствителен к эфиру. Вирус выдерживает неоднократное замораживание - оттаивание и воздействие ультразвуком в течение 10 минут. Полная термоинактивация вируса происходит при 4^oС через 2 недели хранения, при 20-25^oС - через 4 дня, при 37^oС - через 18 часов и при 60^oC - за 10 мин.

Хранение и консервирование
Вирус сохраняется в клеточно-ассоциированном виде в защитной среде с 20% сыворотки крови КРС и 10% ДМСО в герметически запаянных ампулах в жидком азоте при - 196^oС в течение 24 месяцев.

Патогенные свойства
Не вызывает инфекции у эмбрионов и цыплят, контагиозность не установлена. Лабораторные и домашние животные к вирусу не чувствительны.

Иммуногеность штамма
Штамм 3004/ 109 ВБМ предохраняет от развития опухолей в дозе 2000 ФОЕ у 90% цыплят в производственных условиях. Иммуногенность не меняется в течение 5 последовательных пассажей.

Дополнительные признаки и свойства
Штамм 3004/ 109 ВБМ свободен от контаминации бактериальной и грибковой флорой, чужеродными вирусами и микоплазмами, безвреден в 10-кратной дозе для суточных цыплят.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм 3004/ 109 ВБМ является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее не известным изолятом ВБМ.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности признаков, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого способа, изложенных в независимом пункте формулы.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентноспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания изобретения (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1.

Жидкую культуральную вирусвакцину против БМ готовят из апатогенного штамма 3004/ 109. Матриксный штамм и производственные серии вирусвакцины готовят в культуре клеток ФЭК и хранят в жидком азоте. Для получения первичной культуры клеток используют SPF-эмбрионы кур 11-12-суточного возраста. Трипсинизацию эмбрионов проводят по общепринятым методикам. Полученную концентрированную суспензию клеток разводят до посевной концентрации 0,2-0,5 млн/см³ питательной средой, содержащей 30% ГЛАХ, 30% среды 199, 30% среды Игла и 10% сыворотки КРС (ростовая среда). рН готовой ростовой среды 7,0-7,2. Готовую суспензию разливают в бутыли емкостью 3 дм³ по 400-500 см³. Культуру клеток инкубируют при 38,0±0,5^oС в течение 24-36 часов до получения сплошного монослоя на роллерных аппаратах со скоростью вращения 9-10 об/мин. Культуру клеток для титрования вируса культивируют в 50 см³ флаконах (посевная концентрация - 0,5-0,6 млн/см³). Через 24-36 часов в сосуде с культурой клеток проводят смену ростовой среды на поддерживающую. Поддерживающая среда содержит равное количество среды ГЛАХ, среды Игла и среды 199 с добавлением 2% сыворотки крови КРС. Для приготовления матриксной производственной серии матриксный вирус из штамма 3004/ 109 высевают в сосуды с полученной культурой клеток, залитые поддерживающей средой. Количество ампул с матриксным вирусом, используемых для заражения культуры клеток, определяют исходя из титра маточного штамма 3004/ 109 ВБМ. Содержимое ампул объединяют (если позволяет титр вируса, то лучше заражать 1-2 бутыли из одной ампулы) и разводят (или используют без разведения) питательной средой из расчета, чтобы в каждом см³ содержалось 10 000 ФОЕ. Для первого пассажа необходимо заражать не менее 4 бутылей. К моменту сбора вируса типичные фокусные поражения на культуре клеток должны быть отчетливо видны под микроскопом на 30-50% площади монослоя. Монослой с вирусом снимают трипсином и проводят второй пассаж.

Для этого инфицированными клетками, собранными с одной бутыли, заражают свежий монослой из расчета 1:5-1:10, т.е. 5-10 бутылей, и культивируют монослой до съема вируса в течение 48 часов. Вирус второго пассажа поражает гораздо большую часть клеток: в культуре клеток на 50-70% монослоя образуются симпласты и поликариоциты (крупные многоядерные клетки), которые легко можно увидеть под микроскопом. Монослой с вирусом второго пассажа снимают трипсином. После удаления трипсина в бутыли вносят поддерживающую среду с 10% сыворотки крови КРС и 10% ДМСО. Собранные суспензии инфицированных клеток объединяют в общем объеме, фасуют по 1-2 см³ в ампулы, которые подвергают замораживанию и хранят в жидком азоте. Объем производственной расплодки должен быть не менее 800-1000 см³ с концентрацией клеток до замораживания 5-10 млн/см³.

Контроль на безвредность проводят на 20 цыплятах однодневного возраста. Вводят 10-кратную иммунизирующую дозу. Наблюдение ведут 15 дней.

Инфекционную активность матриксной расплодки определяют титрованием на 1-2 -суточной культуре клеток ФЭК, выращенной во флаконах емкостью 50 см³. Активность расплодки должна быть не ниже 1,0•10⁵ ФОЕ/см³.

Для контроля стерильности используют 3-4 ампулы. Высевы делают на мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), тиогликолевую среду и среду Сабуро по 5 пробирок каждой среды.

Маточную (посевную) производственную серию вируса контролируют для исключения контаминации возбудителями БМ, инфекционного энцефаломиелита, псевдочумы, гриппа птиц, инфекционного ларинготрахеита, инфекционного бронхита, оспы птиц.

Контроль проводят методом биопробы на развивающихся эмбрионах кур (РЭК)4-6, 8-9 и 11-12-дневного возраста.

В случае выделения вируса-контаминанта его идентифицируют с использованием специфических сывороток методом постановки РГА, РЗГА, РДП или РН по общепринятым методикам.

Для изготовления производственной серии вакцины используют вирус со 2 по 5 последовательные пассажи (от матриксных производственных расплодок) в культуре клеток ФЭК. Клеточносвязанным вирусом заражают монослойные кульутры клеток и через 72-120 часов инкубации при наличии типичных для вирусов изменений на монослое (30-80% ЦПД) в термальной комнате при 38-40^oС производят сбор инфицированных клеток. Для этого инфицированные монослойные культуры клеток обрабатывают 0,125-0,25% раствором трипсина. После удаления трипсина в бутыли вносят поддерживающую среду с 20% сыворотки крови КРС и 10% ДМСО. Объем среды для сбора и суспендирования клеток составляет 0,02-0,04 см³/см² площади бутыли. В каждую бутыль с суспензией инфицированных клеток, сыворотку крови КРС и ДМСО берут в соотношении 12:16-3:5-1:3 соответственно. Собранные суспензии инфицированных клеток объединяют в общем объеме. Концентрация клеток в суспензии должна быть 5-10 млн/см³. Собранную суспензию инфицированных клеток разливают по 1 см³ в ампулы емкостью 3-5 см³, которые запаивают, замораживают и хранят в жидком азоте. Объем производственной серии вакцины должен быть не менее 500-600 см³. Для контроля вакцины на инфекционную активность оставляют по 3 ампулы каждой серии вакцины.

Технологический контроль производства вакцины включает: контроль на отсутствие контаминации бактериальной и грибной флорой культуральных питательных сред и растворов, применяемых на каждой стадии технологического процесса, а также полуфабриката вакцины, и контроль инфекционной активности полуфабриката.

Контроль выпускаемой жидкой культуральной вирусвакцины против БМ из штамма 3004/ 109 включает: определение внешнего вида, определение контаминации бактериальной и грибной флорой, определение контаминации микоплазмами, определение контаминации чужеродными вирусами, определение безвредности и инфекционной активности.

Титр вируса в вирусвакцине должен быть не ниже 5,5•10⁵ ФОЕ/см³ и не выше 1,0•10⁶ ФОЕ/см³. За одну прививную дозу принимают 2000 ФОЕ. При разбавлении вакцины разбавителем прививная доза должна содержаться в 0,2 см³. Количество доз в ампуле с готовой вакциной должно составлять 400 или 800 доз. Срок годности вакцины при условии ее хранения в жидком азоте 12 месяцев. Вирусвакцина жидкая культуральная из штамма 3004/ 109 применяется с профилактической целью. Вакцинации подлежит клинически здоровая птица однодневного возраста (в первые часы жизни) однократно. Иммунитет формируется через 14-21 сутки после вакцинации. Вакцину в дозе 2000 ФОЕ/0,2 см³ вводят цыплятам внутримышечно в верхнюю часть внутренней стороны бедра или подкожно в область верхней трети шеи в объеме 0,2 см³.

Полученная вирусвакцина против БМ имеет оптимальный компонентный состав, мас.%:
суспензия клеток ФЭК, инфицированных штаммом 3004/ 109 ВБМ - 60,0-80,0
сыворотка крови КРС - 15,0-25,0
ДМСО - 5,0-15,0
Пример 2
Иммуногенную активность вирусвакцины из штамма 3004/ 109 ВБМ, изготовленной предлагаемым способом, определяли в сравнительных опытах на базе ВНИИ защиты животных с использованием коммерческих цыплят-бройлеров, полученных из птицефабрики "Владимирский бройлер". Было сформировано 5 подопытных групп по 50 голов в каждой, которым в суточном возрасте вводили:
1) вирусвакцину из штамма 3004/ 109 ВБМ в дозе 2000 ФОЕ/0,2 см³ (группа 1);
2) вирусвакцину из штамма ВНИИЗЖ / 110 ВГИ в дозе 1000 ФОЕ/0,2 см³ (группа 2);
3) опытный образец сухой вирусвакцины из штамма ВНИИЗЖ/ 110 ВГИ в дозе 2000 ФОЕ/0,2 см³ (группа 3).

Цыплята группы 4 не были вакцинированы и служили контролем вирулентного вируса.

5 группу цыплят не вакцинировали и не заражали. Эта группа служила контролем содержания цыплят и находилась в изолированном помещении.

Через 14 дней цыплята всех групп были заражены вирулентным вирусом БМ из штамма Gm. Наблюдение за птицей проводилось в течение 210 суток. Иммуногенную активность учитывали по результатам клинического и патологического проявления БМ. Эффективность иммунизации рассчитывали по формуле

где
К - % цыплят с патологией БМ в контрольной группе;
В - % цыплят с патологией БМ в вакцинированной группе;
и выражали в процентах.

Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.

Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что все испытанные препараты обладали высокой иммуногенной активностью, достигающей 90%. При этом заболело и пало с признаками БМ 61% цыплят в контрольной невакцинированной группе. В группе контроля условий содержания проявления БМ не наблюдалось.

Пример 3
Производственные испытания вирусвакцины, изготовленной предлагаемым способом, проведены в условиях ОАО "Племптица-Можайское" Вологодской области на цыплятах кросса "Родонит". Вирусвакцину вводили цыплятам в суточном возрасте в дозе 2000 ФОЕ/0,2 см³. Срок наблюдения 200 дней. Результаты испытаний представлены в таблице 2.

В результате проведенных производственных испытаний установлено, что моновалентная жидкая культуральная вирусвакцина против БМ из штамма 3004/ 109 обладает выраженными иммуногенными свойствами и создает иммунитет у 99% вакцинированного поголовья птицы.

Пример 4.

Производственные испытания вирусвакцины, изготовленной предлагаемым способом, проведены в условиях ГУП "Юбилейная" в республике Татарстан на цыплятах кросса "П-46". Вирусвакцину вводили цыплятам в суточном возрасте в дозе 2000 ФОЕ/0,2 см³. Срок наблюдения 180 дней. Результаты испытаний представлены в таблице 3.

В результате проведенных производственных испытаний установлено, что моновалентная жидкая культуральная вирусвакцина против БМ из штамма 3004/ 109 обладает выраженными иммуногенными свойствами и создает иммунитет у 99% вакцинированного поголовья птицы.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- вирусвакцина против БМ, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- при использовании предлагаемого способа изготовления вирусвакцины против БМ на основе штамма 3004/ 109 достигается технический результат, предусмотренный задачей создания изобретения.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации
1. Witter R.L. New Serotype 2 and attenuated Marek's disease vaccine viruses. Comparative efficacy. Avian Dis., 1987, v.31, N4, 752-765.

2. Bivalent Marek's Vaccine. Poultry Intern., 1989, v.28, N8, 44-50.

3. Лукина В. А. , Баррос Палома Е.В. и др. Разработка и внедрение промышленной технологии изготовления новой поливалентной вирусвакцины против болезни Марека. Тез. докл. науч.-произв. конф. "100 лет Курской биофабрике и агробиолог, пром-ти России", Курск, 1996, 182-184.

4. Патент РФ 2144377; МПК⁷ А 61 К 39/255, C 12 N 7/00, C 12 N 5/06 (C 12 N 7/00, C 12 R 1:93); 20.01.2000 г.

5. Witter R. L. et.al. Pathogenicity of variant Marek's disease virus isolates in vaccinated chickens. Avian Dis., 1980, v.24, N1, 210-230.

6. Патент США 4895717, А 61 К 39/12, 23.01.90 г.

7. Пат. ГДР 299046, А 61 К 39/255, 26.03.92 г.

8. Заявка РСТ 93/00112, А 61 К 39/12, 07.02.93 г.

9. Заявка РСТ 93/18790; А 61 К 39/12, 39/15, 39/255; 30.09.93 г.

10. Патент США 5686287; С 12 N 7/00, 7/02; 11.11.97 г.

11. Заявка РФ 96111000/13; А 61 К 39/255, C 12 N 7/00; 10.10.98 г.

12. Rispens B.Y. et.al. Control of Marek's disease in the Netherlands. 1. Isolation of an avirulent Marek's disease virus (strain CVI 988) and its use in laboratory vaccination trials. Avian Dis. 1972, V.16, N1, 108-125 (прототип).

13. Calnek B.W. et al., Amer. J. Vet.Res., 1979, 40,4.

14. Борисова Ю. Ф. , Кириллов Л.В. Ветеринарные препараты. Справочник. /Под ред. Осидзе Д.Ф. - М., Колос, 140-144.

15. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я. и др. Вирусные болезни животных. - М., ВНИТИБП, 1998, 710-712.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Способ включает инфицирование культуры клеток фибробластов SPF-эмбрионов кур штаммом ВГНКИ 3004/ 109-ДЕП вируса БМ 1 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодеражащей суспензии клеток, добавление в вируссодержащую суспензию клеток сыворотки крови крупного рогатого скота и криопротектора диметилсульфоксида в соотношении 12:16-3:5-1:3 соответственно. В результате получают вирусвакцину против БМ с содержанием штамма ВГНКИ 3004/ 109-ДЕП с биологической активностью не ниже 5,5•10⁵ ФОЕ/см³. Изобретение повышает иммуногенную активность и стабильность целевого продукта. 4 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ изготовления вирусвакцины против болезни Марека, включающий инфицирование культуры клеток штаммом вируса болезни Марека 1 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей суспензии клеток, добавление криопротектора и получение целевого продукта, отличающийся тем, что из штаммов 1 серотипа используют штамм вируса болезни Марека, сем. Herpesviridae, род Herpesvirus ВГНКИ 3004/ 109-ДЕП в эффективном количестве. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что инфицируют культуру клеток фибробластов SPF-эмбрионов кур. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что получают целевой продукт с содержанием штамма ВГНКИ 3004/ 109-ДЕП вируса болезни Марека с биологической активностью не ниже 5,5•10⁵ ФОЕ/см³. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, чтo из криопротекторов используют диметилсульфоксид. 5. Способ по п. 1 или 4, отличающийся тем, что в суспензию клеток, инфицированных штаммом ВГНКИ 3004/ 109-ДЕП вируса болезни Марека, добавляют сыворотку крови крупного рогатого скота и диметилсульфоксид в соотношении 12: 16-3: 5-1: 3 соответственно.