Способ получения высокоурожайных клонов миксо-и парамиксовирусов Советский патент 1984 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к вирусоло1йи tt может быть использовано при йодгЬтоВке вакцинных и диагностических штагфюв вирусов. Известен способ повышения репродукции вирусов гриппа путем последовафельпого многократного пассироваЙ1Ш вируса в исследуемой культуре . Однако по этому способу только часть штаммов вируса григата адаптиру стсй к клеточным культурам. Наиболее близким к изобретению является способ получения высокоуроАайных клонов миксо- и парамиксовирусов путем заражения клеточной культуры вирусными штаммами, инкубирования с последующим титрованием, анализом антигенной структуры и отбо ром высокоурожайных вирусных клонов 2. Однако известный способ сложен в осуществлении. Целью изобретения яршяется ускоре ние процесса. Цель достигается тем, что согласно способу получения высокоурожайных клонов миксо- и парамиксовирусов путем заражения, клеточной культуты вирусными штаммами, инкубирования с последующим титрованием, анализом антигенной структуры и отбором высокоурожайных вирусных клонов, заражение осуществляют с множественность инфекции 1-100 на клетку, инкубируют в течение 4-12 ч, затем повторно заражают клеточную культуру отобранным по результатам титрования на курин 1Х эмбрионах вирусным клоном отбирают культуральную жидкость, рекло1 ируют ее на куриных эмбрионах и затем выбирают высокоурожайный вирусный клон. Способ осуществляется след.уюпп- м образом. Клеточную культуру заражают массивной дозой одного вируса (1100 ИД,,/клетку), по завершении этапа адсорбции - проникновения вируса в клетки - проводят многократную отмывку культуры буферным раствором или средой, затем в зараженную культуру вносят питательную среду, культуру инкубируют при 37°С5 начиная с 4 и до 12 ч, после заралсения (в течение первичного цикла репликации) извлекают пробы культурапьной жидкости, этот материал клонируют предельными разведениями на куриных эмбрионах или методом бляшек на клеточнь х культурах для выделенкя вибри онов, дающих вирусное потомство с наиболее высокой репродукционной активностью. Полученные субпонуляции однократно реклонируют, Пример 1. Получение высокоурожайного клона вируса гриппа Л (Ленинград) 385/80 для приготовления опытных серий гриппозной тканевой вакцины, В качестве исходного материала для получения высокоурожайного для клеточной культуры из почек телят вирусного клона использовали вакцинНс 1й А(Ленинград)385/80, предназначенный для производства инактивированной аллантоисной гриппозной вакцины. Клеточную культуру из почек телят, выращенную на 10 пробирках в среде Игла с 10%-ной сыворотки крупного рогатого скота, однократно отмьта.лн средой Игла от св воротки, Вирус {тигр-10°:ЭИД5-о/0,2 vm) в 10 раз разводили средой Игла. Клеточные культу ры заражали разведенньв-i вирусом (по 1 мл на пробирку, множественность инфицирования - 10 ЭКД ./клетку) и помещали н термостат при 37°С. Через 1 ч вирус удаляли, культуры от- г/ ывали трилуцы теплой средой Игла (по 5 мл) от не адсорбировавшегося вируса,, после чего вносили ту же среду (по 1 мл) и культуры помещали в термостат,, Через 2,4,6,8 и 10 ч после заражения собрфали формирующиеся субпопу ляции вируса. Для этого на указанных сроках культуральную жидкость из 10 пробирок полностью отсасывали, а В пробирки с культурой вносили по 1 мл свел;ей теплой среды. Собранные популяции подвергали титрованию ка куриных эмбрионах с Ю до Ю , используя по 5-30 эмбрионов на каждое разведение. Исходный заршкаюцщй вирус титровали с 10 до , Результаты титрования учитывали через 48 ч инкубации куриных эмбрионов при 37°С. Первичный учет заключался в определении присутствия гсмагглютининов в каясдом из зар,аженных эмбрионов. Содержание инфекционного вируса в суСпопуля1ги:х, собранных через 2,4, 6s8 и 10 ч после заражениясоставило 4,2; 5,2| 4,1| 2,8; и 4,2 Э;ит / /0,2 мл. Первичный цикл репродукции с выходом инфекн. потомстяа завершен через 4 ч после заражения (увеличение титра на 1 6р, ЭЙД,. / /0,2, мл). Для определения репродукционной активности вирусов в составе исходной популяции и субпопуляции вновь сформированного вирусного потомства дополнительно определяли титры ГА в положительных по РГА пробах аллантрисной жидкости, собранной из куриных эмбрионов, зараженных вирусом в дозе 10 и 10 ЭЙД 50Наиболее репродуктивные вирионы (титр ГА - 1:2048) содержались исклю чительно в 4- и 6-часовых субпопуляцих и не обнаруживсшись при тех же условиях в составе исходного вируса и 8-10-часовых субпопуляций; Для получения чистых клонов пробу вируса с титром ГА 1:2048 из 4-часЬвой субпопуляции подвергали реклонированию на куриных эмбрионах. В результате реклонирования содержание высокорепродуктивных частиц в полученной субпопуляции резко повысилось (9% куриных эмбрионов содержали вирус с титром 1:2048, 17,8% - с тигром 1:4096). Использование полученных высокорепродуктивных клонов для заражения клеточной культуры из почек телят позволило повысить титры ГА с 1:321:128 до 1:128-1:1024, инфекционного ,вируса с 7,8 до 9,3 й ЭЙД55/ /0,2 мл. На материале повторных 130 наблюдений рассчитаны средние геомет рические титры инфекционного вируса и гемагглютининов, формирующихся после заражения клеточных культур исходным вирусом и высокорепродуктивным клоном, полученным в результате разделения исходной популяции по ско ростям репродукции. Титры гемагглгати нинов при использовании высокорепродуктивных клонов повьппались в средне в 2,3 раза, инфекционного вируса в 31,6 раза. Вся процедура получения высокоурожайного клона заняла 8 суток, в том числе: первичное заражение кл точной культуры вирусом, сбор субпопуляций и их титрование на куриных эмбрионах (1 сут); инкубация зараже ньк эмбрионов при 37°С (2 сут); учет результатов титрования и отбор высо коурожайных скоростных вирионов вируса (1 сут); повторное заражение клеточной культуры высокоурожайным клоном и реклонирование собранной культуральной жидкости на куринь1Х эмбрионах (3 сут) ; п.ет результатоЕин отбор высокоурожайных клонов (1-сут). Итого 8 сут, Полученный высокорепродуктивньй клон использован для получения 65 л вирусной биомассы в клеточной культуре 1П в целях изготовления опытных серий тканевой инактивированной гриппозной вакцины. Пример 2. Получение высокоурожайного клона вируса гриппа А (Техас)1/77 для приготовления тканевого гриппозного диагностикума. Клеточную культуру ОДСК, выращенную на поверхности 4 матрасов емкостью 100 мл, заражали по 1 мл вируса в разведении 1:10, содержавшем 10 ЭЙД /клетку. Через 1 ч заражения вирус удалялм, культуры 3 раза отмывали фосфатным буферным раствором (по Ш мл), на монослой наносили гиперимтч1ную гомологичную крысиную сыворотку (титр в Р1ГА 1:1280) по 1 мл в разведении 1:20. Чере,з 60 мин инкубации при 37°С сыворотку удаляли, монослой трижды отмывали от антител буфером, в каждый матрац вносили по 10 мл поддерживающей среды Игла. Через каждый час в течение первых 10 ч репликации, а также через 24, 48 и 72 ч после заражения из матрасов отбирали по 0,5 мл вируса, гомологичные пробы объединяли и использовали для титрования вируса на куриных эмбрионах (с до Ю). Отобранное из матрасов количество среды восполняли добавлением аналогичного объема (0,5 мл) среды Игла, культуры вновь помещали в термостат. Содержашге вируса в к льтуральной жидкости в интервале 2-7 ч составляло 1,7-2,5 eg ЭВД5дО,2 мл. Отчетливое увеличение инфекционных титров (высвобождение вновь сформированного вирусного потомства вследствие завершения первичного репликативного цикла) отмечено через 8 ч после заражения (4,6 tg ЭВД5о/0,2 мл). Определение репродукционной активности вирионов в субпопуляциях вируса, полученных на разных стадиях репликатинного цикла, показало, что высокорепродуктивные частицы удается обнаружить в составе 8-часовой пробы (время завершения первичного репликативного цикла) и 10-часовой -пробы вируса (вскоре после завершения цикла) в 11 и 16,7% от общего числа зараженньпс эмбрионов. Высокорепродуктивные частицы не удалось обнаружить ни в одной из б проб, собранных до завершения циклгг репродукщт вируса А(Техас)1/77 в клетках 1-ШСК, а также на более поздних стадиях ренродукции (24, 48, 72 ч после заражения), В результате реклонирований 8-часо-воп пробы на куриных эмбрионах полу461 высокоурожайный скоростной клон вируса А(Техас)1/77. Изучение стабильности признака высокой репродуктивности нолученного клона вируса проведено на 10 последовательных пассажах вируса, выполненных на куриных эмбрионах и в клетках ЩСК. lIpiisHaK высокой репродуктивности сохранялся на протяже нии 10 нассажей. Средний геометричес кий титр гемагглютининов скоростного варианта по сравнению с исХОДНЫГ- в 3,5 раза., инфек Д-1О1{Ного вируса - в 99,3 раза при репродукции в клеточной культуре МДСК, использованной в качестве системы для разделения поиуляции по скоростям репродукции. Показатели репродукцргл скоростного варианта вируса А(Техас) 1/77 в куриных эмбрионах повып1ши-1сь по отношению к исходному вирусу в 2 раза по титрам ГА и в 8,9 раз по инфекционной активности. Полученный высокорепродуктивный клон вируса гриппа А(Техас)1/77 начи ная с 1980 г используется для приготовления тканевых гриппозных диагнос в отделе экспериментальных препаратов ВНИИ гриппа в целях обеспечения диагностической работы опорных баз Всесоюзного и Регионального центров по гриппу. За этот период подготовлено 36220 мл тканевьп грип позньпс дигностикумов с титром в РГА 1:64-1:1024 и титром в РСК - 1:81:32. П р и м е р 3. Неточную культуру Детройт-б заражали парагриппозным вирусом 3 типа при множественности инфекции 1 ГИДjg/клетку. Через 2 ч адсорбции при 37°С вирус удаляли, культуру обрабатывали иммунной сывороткой к вирусу парагриппа 3 типа (30 мин при ), после сыворотку удаляли, монослой отмывали фосфатным буфером, в культуру вносили по15держивающуго среду Игла. Через 6, 12 18 и 24 ч после заражения отбирали пробы культуральной жидкоети, содержащей вновь сформированное вирусное потомство, которое титровали методом пляк. С этой целью десятикратными разведениями вирусов (попу- ляции через 6-24 ч после заражения) заражал:-, культуры клеток, выращенные на боковой стенке 50 мл матрацев. Через час инкубации при 37°С вирус удаляли, монослой покрывали первым агаровым покрытием, включающим среду 199, 0,9% агарозу и 2,5% обезжиренное молоко. Через 4 сут инкубации при 37°С в инвертированном положении на монослой наносили второе красящее агаровое покрытие, состоящее из 0.,9% агарозы и нейтрального красного (1:7500). Реакцию учитывали через 1 сут инкубации культур при 37°С. Определяли количество и размер блящек. Инфекционные титры в пробах через 6,12,18 и 24 ч после заражения составляли О, 10, 9x103, 5х10гаД5д/ /0,5 мл соответственно. При этом в 12 и 18-часовых пробах содержались вирионы, формирующие наиболее крупные бляшки, диаметром 3-3,3 мм (соответственно в 15,2 и 6,5% от общего числа блящек)„ Таких вирионов не удавалось обнаружить при титровании проб, полученнык на более поздних сроках культивирования (24 ч и позже). Реклонирование крупнобляшечных вариантов .показало, что этот признак наследуется генетически. Сравнение репродукционной активности крупно, средне и мелкобляшечных вариантов ноказало, что кругичобляшечный вариант ШБЗ и его производный Ш-ОБЗ, полученный в результате реклонирования виру-, са, обладают повышенной репродукционной активностью (титры инфекционного вируса 6,2-6,6 р;БОЕ/0,5 мл по сравнению с 4,2-5,7 о;БОЕ/0,5 мл у исходного вируса и 4,0 Eg БОЕ/ /0,5 мл у среднебляшечного варианта). Мелкобляшечные варианты обладали редуцированной способностью к репродукции (Ог2,,0 ,Eg БОЕ/0,5 мл). Таким образом, крупнобляшечные клоны парагриппозного вируса 3 типа, вьщеляемые иск.л очительно из ранних субпопуляций вируса, обладают повьппенной репродукционной активностью, что определяет целесообразность их использования для изготов1 ения парагриппозных антигенов и диагност11кумов. Предлагаемый способ по сравнению с известным обеспечивает значительное

711094358

сокращение времени получения высоко- производства вакцин и диагггостикумов урожайных клонов миксо- и парамиксо- дает существенный экономический .эфви15усов, что в условиях массового фект.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОУРОЖАЙНЫХ КЛОНОВ цiкco- и ПАРАМИКСОВИРУСОВ путем заражения клеточной культуры вирусными штаммами, инкубирования с последующим титрованием, анализом антигенной структуры и отбором высокоурожайных вирусных; клонов, о т л и.чающийся тем, что, с целью ускорения процесса, заражение ccynieствляют с множественностью инфекции 1-100 ВДср ча. клетку, инкубируют в течение 4-12 ч, затем повторно заражают клеточную культуру отобранным по результатам титрования на куриных эмбрионах вирусным клоном, отбирают О 9 культуральную жидкость, реклонируют ее на куриных эмбрионах и затем выби(Л рают высокоурожайный вирусный клон.