Способ получения защитного соматического антигена коринебактерий дифтерии Советский патент 1980 года по МПК A61K39/05 

t

Изобретение относится к области медицины, а именно к инфекционной иммунологии.

Известен способ получения защитного соматического антигена корине- 5 бактерий дифтерии путем выращивания микроорганизмов на питательной среде с последуюшим высушиванием биомассы, экстракцией из них целевого .продукта и его фракционированием 1, 10

Однако соматический антиген коринебактерий дифтерии, полученный известным способом, проявляет малую защитную активность при высокой токсичности. 15

Целью изобретений является повышение иммуногенности и снижение токсичности антигена.

Эта цель достигается тем, что в процессе фракционирования выделяют 20 фракцию с молекулярным весом более 300000 дальтон.

Способ поясняется следующим примером.

П р и м ер. 5940 мг сухой мик- 25 робной массы коринебактерий дифтерии (штамм №665 П серовара, гравис, токсигенный) взвешивают в 600 мл 0,5%-ного раствора дезоксихолата натрия на Трис-НС1 буфере, М. 0,005 рН 30

8,6. Проводят 18-часовую экстракцию на холоду (+4) при непрерывном встряхивании. Экстракт отделяют от осадка центрифугированием (20 мин при 3000 и 20 мин при 15000) и подвергают диализу. Диализ проводят на холоду в четыре этапа: против фосфатного буфера М 0,01, рН 7,7, против того же буфера М 0,02, рН 7,2, против дистиллированной воды и против Трис-НС (буфера М 0,005, рН 8,6.Экстракт пропускают через бактериальный фильтр со стерилизующей мембраной МФА 0,2 (размер пор О,2.мкм).

Затем на приборе для ультрафи.)1ьтрйции экстракт пропускают через четыре мембраны Диафло с последователь но возрастающими размерами пор: ИМ 2ОЕ, ХМ 50, ХМ 100 и ХМ 300. Разведение и промывку промежуточных и окончательных концентраций проводят Трис-НС1 буфером рН 8,6. С мембраны ХМ 300 собирают 14,6 мл концентрата (78 мг по сухому весу), т.е. выход этой фракции равен 1,2-1,6% от исходной массы бактерий.

Концентрат с мембраны ХМ 300 представляет собой фракцию дезоксихолатного экстракта с молекулярным весом болел 300000 дальтон. По химическому

составу фракция являемся комплексом из белка (89,5%), полисахаридов (8,3% ,И нуклеиновых кислот (2,2%),

Полученная предлагаегйым способом фракция соматических антигенов крринёбактерий дифтерии характеризуется высокой степенью иммуногенности при бтсутствиитоксичности, что подтверждается следуюги ми материалами. Несколько групп животных (морские свинки) были иммунизированы высокомолекулярной фракцией соматичес «их а нтигёнов коринебактерий дифтеJMtH. Рш1и применены разные схемы

иммунизации и дозы антигена. Для по лучения сравнительных данных параллельно по тем же схемам другие свинки иммунизированы нйзкомолекулярными фракциями. Контролем служили неиммунизированные животные. Для определения напряженности антимикробного иммунитета, полученного в ответ на иммунизацию,свинки всех групп были одновременно зараженй живой вирулентной культу рой CTdiphtheriae, временно лишенной способности токсинообразования. Результаты опыта приведены я таблице.

Как видно из таблицы, уровень антибактериального иммунитета у мор скйх СВИНОК, иммунизированных высокомолекулярной фракцией соматиче:ски антигенов коринебактерий дифтерии, достаточно высок, чтобы противостоя заражению животных безусловно смертельной дозой (ДЛ). Приведенные материалы позволяют считать высокомолекулярную фракцию (м.в.ЗОС1000 дальтон) дезоксихолатЙбго экстракта коринебактерий дифтерии защитным соматическим антигеном этого микроба. Защитный соматический антиген коринебактерий дифтерии в очищенном биде выделен впервые и мокет быть йспользован как основа химической, вакцины, с помощью которой устраняо ся дефицит противогликробных антител у больных дифтерией или бактерионосителей . Формула изобретений Способ получения защитного соматического антигена коринебактерий дифтерйй вйращивания .микроорганизмов на питательной среде, с последую-щим высушиванием биомассы, экстракцией из них целевого продукта и его фракционированием, О т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения иммуногенности и снижения токсичности антигена, в процессе фракционирования выделяют фракцию с молекулярным весом более 300000 дальтон. Источники информации,, принятые во внимание при экспертизе 1. Филиппова Л.М. с соавт. Водно солевс1Я экстракция коринебактерий дифтерии с осаждением белковых фракций Труды МНИИЭМ; 1969, 13, с. 77.