Способ получения вакцин против лейкоза крупного рогатого скота Советский патент 1987 года по МПК A61K39/12 C12N5/00 

00

rsD Изобретение относится к области ветеринарии, в частности, к способам производства вакцин против лейкозных заболеваний крупного рогатого скота. В настоящее время известен способ получения вакцин против лейкозных заболеваний у различных животных. В качестве примера можно указать способ получения вакцины для иммунизации птиц против лимфоидного лейкоза и эритробластоза путем получения смеси живых клеток и измельченных : тканей, инфицированных этим вирусом в фармацевтической жидкости, при этом концентрация смеси такова, что в 10-2000000 мл жидкости содержится 1 г смеси. В качестве исходного материала используют ткань почки, селезенки или печени больного животного. Известна также вакцина против лей коза кошек, получаемая из клеток: культуры, инфицированной вирусом лей коза кошки. Вакцина состоит из клеток, .зараженных вирусом лейкоза кошки или из инактивированных частиц вируса лейкоза кошки, выделенныхиз клеток культуры. Однако вакцины, полученные известным способом, неэффективны для пр дупреждения лейкоза крупного рогато го скота. Кроме того, вакцины, полу ченные известными способами, содержат нуклеиновые кислоты как вирусно го, так и клеточного происхождения, которые опасны как источник опухолевой информации с потенциальной во можностью индуцирования опухолевого заболевания. Как недостаток известных способо следует отметить, что дпя получени . иммунизирующего материала требуется забивание животного - донора. Целью настоящего изобретения является повьшение иммуногенных свойс вакцины. В качестве вирусосодержащих клеток используют лейкоциты пер ферической крови крупного рогатого скота, больного лейкозом, при этом отделенные клетки и вирусный матери ал подвергают разрушению с одновременным инактивированием содержащихся в них нуклеиновых кислот и после дующим вьщелением белковых фракций р 25 и gP 70, используемых в качестве иммунизирукзщего агента. Пример 1. Из периферической крови методом гемолитического тока 52 эритроцитов с последующим восстановлением изотопичностираствора выделяют лейкоциты. После чего производят засев в культуральную среду следующего состава: ина|:тивированная бычья сыворотка - 10%, 0,5-лактагумин - 20%, среда Игла - 70% из расчета 5-10 клеток на 1 мл среды. После 72 ч. „культивирования отделяют культуральную среду, при этом осаждают лейкоциты центрифугированием при 1600-1800 об/мин в течение 20 мин. Лейкоцитарные клетки разрушают в буфере А (неионный детергент тритон X 100) до 1%-ной конечной концентрации, затем производят обработку магнитной мешалкой в течение 1 ч при температуре , центрифугируют при 25000-30000 об/мин в течение 1ч. Супернатант подвергают диализу в течение, 12-15 ч, после чего центрифугируют при тех же оборотах, отделяя антигенбелковзто фракцию. Антиген подвергают лиофильной сушке. Полученный материал вводят в предлопаточньй лимфоузел телятам в возрасте 1-3 месяца с полным адьювантом Фройнда в соотношении 1: Г. Доза иммуногена определялась по белку,количественное определение которого проводилось по методу Лоури (журнал Biological Chemistry, v. 193, № 1, стр. 265, 1951). Иммунизацию проводят трехкратно с интервалом 10-12 дней. Вторая, третья и четвертая иммунизация без адьюванта Фройнда. Через 4 недели после четвертого введения препарата в периферической крови иммунизироч ванных телят констатированы реципитирующие антитела к вирусным белкам Р70 и Р25 в титрах 1:16-1:32. Напряженность иммунитета составляет 6 месяцев. Пр и м ер 2. Культуральную жидкость после отделения лейкоцитов осветляют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин, затем проводят дифференциальное центрифугирование при 30000 об/мин в течение 1,5 ч. Осадок ресуспендируют в буферном растворе THE, растирают в поттере Даунса и осветляют при 6000 об/мин, Йолученньй вирусный материал обрабатывают тритоном X до конечной концентрации 0,04% и подвергают многократному криолизу. 38 Полученньш продукт деструкции вирусного препарата совместно .с полным адьювантом Фройнда вводят в шейный лимфоузел в следующих дозах по белку: 1-я иммунизация - 20 мг/мл, 2-я 30 мг/мл, 3-я - 50 мг/мл. Схема иммунизации аналогична примеру 1. Титр антител к вирусным белкам через 3-4 недели равен 1:8-1:16, Примерз Вьщеляют белковые фракции Р25 и gP70 следующим методом Вирусный материал, полученный в примере 2, очищают дважды в градиенте сахарозы 15-60%, обрабатывают тритоном X 100 до концентрации 0,005% и помещают в термостат при З7с на 1 ч Полученный материал осветляют при 30000 об/мин в течение 90 мин, под|вергают диализу против фосфатного бу ферного раствора в течение суток при +4°С, вновь осветляют при 6000 об/ми в течение 10 мин, Супернатант подвер гают фракционированию на аппарате изоэлектрофокусировки. Собранные бел ковые положительные фракции в реакци ИД в агаре объединяют, рН зоны 7,27,5 (пик 7,4), Затем полученньш мате риал подвергают диализу против 0,01 мл фосфатного буфера при +4 С в течение суток со сменой буфера. Материал концентрируют акрилексом очищают на колонке ифадекс Д-100,. Выделенные белковые фракции совместно с полным адьювантом Фройнда вводя в предлопаточный лимфоузел в следую- 35 щих дозах по белку: 1-я иммунизация 10 мг/белок, 2-я - 15 мг/мл, 3-я 25 мг/мл. Схема иммунизации аналоги на примеру 1, Титр антител через 3-4 недели после 3-ей иммунизации равен 1:321:64, Пример 4, Из периферической крови больного лейкозом крупного рогатогО скота животного вьщеляют кле ки, как описано в примере 1. Полученные нативные клетки разрушают в буфере А (Неионный детергент тритон X 100) до 1% конечной концентрации. Затем производят обработку на магнитной мешалке в течение часа при температуре , центрифугируют при 25000-30000 об/мин в течение часа. Супернатант подвергают диализу в течение 12-15 ч, после чего центрифугируют при тех же оборотах, отделяя белковые фракции Р25 и gP70 антиген, который подвергают лиофильной сушке. Полученный материал вводят в надлопаточный лимфоузел телятам в возрасте 1-3 месяца с полным адьювантом Фрейнда по ёелку: 1-я иммунизация - i 25 мг/мл, 2-я иммунизация - 37,5 мг/мл, 3-я - 60 мг/мл. Схема иммунизации аналогична примеру 1, Титр антител к вирусным белкам 3-ей иммунизации через 4-5 недель равен 1:16-1:32. Пример 5,, Культуральную жидкость 72-х часовой культуры лейкоцитов , полученных от больных животных сливали, осветляли при 5000 об/мин. в течение 10 мин, затем при 12000 об/мин в течение 30 мин, Надосадочную жидкость собирали и центрифугировали при 30000 об/мин (950000 g) на центрифуге VAC-601 в угловом роторе мл в течение 1,5 ч. Полученный осадок ресуспендировали в малом объеме буфера TNE, содержащего 0,01 М Трис-НС1; М NaCl; 0,001 М ЭДТА рН - 7,4, гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе, Гомогенат центрифугировали при 8000-9000 об/мин в течение 30 мин, Надосадочную жидкость подвергали очистке, пропуская материал через слой 20% раствора сахарозы при 30000 об/мин в горизонтальном роторацентрифуги VAC-601 в течение 1 ч,Осадок после данного этапа очистки снова суспендировали в буфере TNE, гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе и подвергали очистке в линейном градиенте концентраций сахаро- зы. Градиент готовили при помощи градиентообразователя из 15% и 60% растворов сахарозы,,. На приготовленный градиент наслаивали вирусную суспензию, очищенную через слой 20% раствора сахарозы. Центрифугировали в горизонтальном роторе мл центрифуги VAC-601 при 3000 об/мин в те;чение 4-х ч. Градиент после центрифугировання фракционировали и фракции собирали при помощи перистальтического насоса КБ или автоматической системы регистрации Uvicord и фрак-, ционного коллектора установки Colo- . га (ЬКВ-Швеция), Фракции с плотностью 1 , 16-1 , 18 г/мл собирали, переосаждали при,30000 об/мин (95000 g) в центрифуге VAC-601 в течение 1 ч, Собранные осадки ресуспендировали в TNE буфере, разливали во флаконы или ампулы и хранили,при (срок хранения 6-8 месяцев), 5 Пример 6. Антигенные экстрак а)Клетки 72-х часовой культуры .лейкоцитов, полученных от больньпс лимфолейкозом коров были собраны, отцентрифугированы при 1200 об/мин в течение 20 мин, отмыты три раза 0,85% раствором NaCl с последующим осаждением при 1200 об/мин в течение 20 мин. Клетки дизировали, ресуспен дируя их в буфере А, содержащем 0,02 М Трис-НС1; 0,3 М КС1, 0,01 К азида Na, и 1% тритона Х-100; рН-7,8. Суспензия встряхивается на холоде (+4) в течение 1 ч, осветляется центрифугированием при 24000 g (/V 20000 об/мин) в течение 45 мин (+4). Надосадочную жидкость собирали,, диализировали против дистиллированной воды (1:2000) в течение суток. Экстракты после диализа вновь осветляли при 24000 g - 45 мин (+4С б)антигенные экстракты из очищенного и концентрированного вируса БЛВ. Вирус, очищенный двумя циклами дифференциальногоцентрифугирования и центрифугирования в градиенте плот ности сахарозы 15-60%, ресуспендировали в THE буфере, содержащем 0,01 М Трис-НС1, 0,1 М NaCl, 0,001 М ЭДТА; рН - 7,4. Вирус разрушали добавлением к сус - - - пензии тритона Х-100 в концентрации 0,5% инкубировали смесь с тритоном;в течение 1 ч при . После инкубации смесь центрифугировали при 30000 об/мин в течение 1,5 ч. Осадки после центрифугирования отбрасыва ли, надосадочную жидкость диализовали против воды (1:400) за ночь при +4 С с двумя сменами воды. Материал ,повторно осветляли центрифугирование . :,„„ ,.„ при bOOOoб/ шн в течение 10 мин. П р и М е р 7. Антигенные экстрак ты клеток, и вируса (описано выще)- на носили в колонку LKB (по мл) для, изоэлектрофокусирования. Условия йзоэлектрофокусирования.: амфолины l%j диапазон рН 3-10; начальные параметры: V - 300 В; I - 8 мА; W 2,4 Вт; конечные параметры: V - 300 I - 0,8 мА; W - 0,24 Вт; время фокусирования - 48 ч. Собирали фракции с колонки по 40 капель с одновременным измерением рН и А (оптической плотности) Все собранные фракции тестировали в иммунодиффузии. Собирали фракции, положительно реагирующие с сывороткой крупного рогатого скота, специфичной к р-25 БЛВ. Положительно реагировали фракции в зоне рН 7,3-7,5, пик активности - в точке рН 7,4. Положительные фракции собраны, отдиализованы против 0,01 М фосфатного буфера. Следующий этап очистки проводили на колонке с сефадексом Г-100 (1,5 хЮО см с водяным охлаждением) .Сефадекс -Г-100 предварительно многократно отмывали от мелких частиц и уравновешивали буфером, содержащим 0,05 М Трис-НС1, рН - 7,8; 0,3 МKCli 0,01% тритона Х-100. Фракции колонки проверяли в иммунодиффузии со специфической сывороткой. Собирали положительно реагирующие фракции. Очищенный таким образом белОк в полиакриламидном геле при электрофорезе дает полосу в зоне с молекулярным весом 25000 дальтон. П р и М е р 8. Вьщеление двойного антигена. Вирус концентрируют из культуральной жидкости вируспродуцирующей культуры сульфатом аммония, Для этого: к культуральной жидкости добавляют сухой сульфат аммония из расчета 30 г/100 мл среды; ох, о„ лаждают при 4 С в течение ночи; центрифугируют при 1000 об/мин 1 ч и надосадочную жидкость сливают; осадок ресуспендируют в дистиллированной воде 1:10 объема; охлаждают ночь и центрифугируют при 1000 об/мин 30 мин. Надосадочную жидкость оставляют, осадок отбрасывают; надосадочную едкость диализуют против фосфатно-солевого буфера; после диализа - 7 жидкость концентрируют ультрафильтрат цией (Amicon - аппарат, мембраны Ш10) в 100 раз по отнощению к исходному объему; после концентрирования материал центрифугируют при 30000 g и течение 1 ч. Супернатант собирали. Он содержит оба антигена - Р-24 и гликопротеин. Таким образом,, разработан способ получения эффективной и безопасной вакцины против лейкоза крупного рогатого скота при котором животное донор остается живым. В результате применения данной вакцины получены

7 .8200158

высокие титры антител до l:32-lV6A, иновых кислот, являюпщмися источниа также устойчивый напряженный имму-, ком опухолевой информации потенциальнитет. Кроме того, данный способ по- но опасной в системе индуцирования зволяет получать вакцину без нукле- опухолей.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫПРОТИВ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО ;ско-.ТА, включающий культивирование ви~ руссодержащих клеток, отделение клеток и вьщеление' • вирусного материала из культуральной жидкости,- отличающийся тем, что, с целью повьшения иммуногенных свойств вакцины, в качестве вируссодержащих . клеток используют лейкоциты периферической крови крупного рогатого скота, больного лейкозом, при этом отделенные клетки и вирусный материал подвергают разрушению с одновременным инактивированием содержащихся в них нуклеиновых кислот и последующим вьщелением белковых фракций р 25, и gP 70, используемых в качестве иммунизирзтещего агента.(Л