Способ получения эхинококкового диагностического антигена для иммуноферментного анализа Советский патент 1989 года по МПК A61K39/00 G01N33/53 

3136356/4

550 мл геля сефадекса Г-200, уравно- мывают на фильтре последовательно вешенной 0,05 М трис-НС1-буфером с 0,5 М NaC1, водой, 0,5 М NaOH, водой, добавлением 0,3 М КС1 (рН 8,2). На 0,5 М NaCI и, наконец, стартовым бу поверхность геля наносят до 20 мл об- ,. фером (0,01 М трис-HGI, рН 8,2). разца и элюируют тем же буфером со скоростью 13 мл/ч о К моменту появления в элюате первых порций белка (после выхода примерно 150 мл с начала элюции) включают хроматографиче-fo олсий коллектор, отрегулировапньгй на 40-минутные интервалы времени, и собирают фракции объемом по 10 кп, Пос- ле сбора 70 фракций элюцию прекращают. Из каждой фракции отбирают образцы по 0,2 МП, разбавляют их в 3 мл воды и фотометрируют при 280 нм на спектрофотомере. Затем строят гра- фш элюции, откладывая по горизонтали объемы элюата (Vg) в , а по верти- 20 покрытую диском фильтровальной бума- кали результаты фотометрировання ги (лучше использовать колонку, имею- (процент светопропускания, Т %),

Иммунологическую активность исход него концентрата и каждой фракции оп

Подготовленный гель упаковывают в хроматографическую колонку (2 см X 15 см)5 имеющую 30 ьш геля, и уравновешивают ее стартовым буфером.

Концентрированный пул, полученный при гель-фильтрации высокомолекулярных фракций (К(-,: O-Oj 4) с содержанием белка. 6-7 мг/мл обессоливают посредством диализа против стартового бу- IS фера. Быстрее можно обессолить материал па колонке.с сефадексом Г-25, уравновешенной стартовым буфером,

20 мл обессоленного образца наносят на поверхность анионообменника.

щую а,цаптор, облегчающий нанесение образца) и элюируют с использованием ступенчатого градиента концентрации

ределяют реакций иммунодиффузии с ис-25 хлористого натрия, растворенного в

стартовом буфере. Объемы каждого элю ента долж1 Ъ быть не менее 80 мл. С применением 6 ступеней градиента кон центра1щи соли собирают свыше 100 30 фракций объемами по 3 мл, Калсдую фрак цию фотометрируют при 280 нм и строя график элют-щи,

Фракции, соответствующие пикам оп тической плотности, объединяют в пу- ЛЫ; концентрируют до исходного объема (до объема который имел образец до фракционирования) и исследуют их антигенную активность

Каждая из 6 пулов в реакции иммупользованием активных иммун шгх сывороток, полученных от зараженных: или иммунизированных животных или от людей больных эхинококкозом, Результа ты реакции (титры антигенов) таюке отражают на графике,

Иммунологически активные комюнен™ ты эхинококковой жидкости распределяются во фракщ-гях, объемы элюгдии которых (Vg) находятся в пределах 200-400 мл, что соответствует велн ш- не коэффициента распределения от О до 35 (рассчитано по формуле

Кд vJ-SV™ 40 иодиффузии с сыворотками людей, боль

35

в колонке Vg -обтаем элшции или объем выхода данной фракции, V ™ с зободный объем геля К - величина постоянная, для данной КОЛОНКИ; поэтому с учетом этой величины нужные фракции при использовании одной колонки могут быть отобраны даже без предварительного определения их антигенной активности) .

&ракции, в которых обнарулсена аи- . тигенная активность ( от О до 0,35), объединяют, остальные фракции 0,35 до 1,0) отбрасывшото

Дальнейшую очистку проводят методом ионообменной хроматографии на ДЕМ-сефадексе , Для этого 2 г сухого анионообменника суспендируют в течение суток.в 0,01 М трис-НС1 . .буфер-е (рН 8j2), Разбухший гель проньк эхинококковом, обладал определен ной антигенной активностью, причем в некоторых пулах найдены различающиеся, в некоторых - одинаковые антиген ные компоненты и число их в разных пулах различно.

Небольшую активность проявляют пу лы 4, и 5, элюируе1чые соответственно в диапазоне концентрагии хлористого натрия 0.,(,3 М и 0,3-0,4 М. По результатам им зукодиффузни эти фракции негомогенны и включают до 3 антигенных компонентов, выявляемых разными сыворотками, причем в антигенном от- j ношении пулы 4 ,и 5 почти не различа- ются, При их анализ.е нммунофермент- ным методом с использованием сывороток .свиней с экспериментальным эхино кокковом также показана наи большая

50

мывают на фильтре последовательно 0,5 М NaC1, водой, 0,5 М NaOH, водой, 0,5 М NaCI и, наконец, стартовым бу ,. фером (0,01 М трис-HGI, рН 8,2). o 0 покрытую диском фильтровальной бума- ги (лучше использовать колонку, имею-

Подготовленный гель упаковывают в хроматографическую колонку (2 см X 15 см)5 имеющую 30 ьш геля, и уравновешивают ее стартовым буфером.

Концентрированный пул, полученный при гель-фильтрации высокомолекулярных фракций (К(-,: O-Oj 4) с содержанием белка. 6-7 мг/мл обессоливают посредством диализа против стартового бу- S фера. Быстрее можно обессолить материал па колонке.с сефадексом Г-25, уравновешенной стартовым буфером,

20 мл обессоленного образца наносят на поверхность анионообменника.

мывают на фильтре последовательно 0,5 М NaC1, водой, 0,5 М NaOH, водой, 0,5 М NaCI и, наконец, стартовым бу фером (0,01 М трис-HGI, рН 8,2). покрытую диском фильтровальной бума- ги (лучше использовать колонку, имею-

щую а,цаптор, облегчающий нанесение образца) и элюируют с использованием ступенчатого градиента концентрации

стартовом буфере. Объемы каждого элю™ ента долж1 Ъ быть не менее 80 мл. С применением 6 ступеней градиента кон- центра1щи соли собирают свыше 100 фракций объемами по 3 мл, Калсдую фрак-- цию фотометрируют при 280 нм и строят график элют-щи,

Фракции, соответствующие пикам оптической плотности, объединяют в пу- ЛЫ; концентрируют до исходного объема (до объема который имел образец до фракционирования) и исследуют их антигенную активность

Каждая из 6 пулов в реакции иммуиодиффузии с сыворотками людей, боль

0 иодиффузии с сыворотками людей, боль

ньк эхинококковом, обладал определенной антигенной активностью, причем в некоторых пулах найдены различающиеся, в некоторых - одинаковые антигенные компоненты и число их в разных пулах различно.

Небольшую активность проявляют пулы 4, и 5, элюируе1чые соответственно в диапазоне концентрагии хлористого натрия 0.,(,3 М и 0,3-0,4 М. По результатам им зукодиффузни эти фракции негомогенны и включают до 3 антигенных компонентов, выявляемых разными сыворотками, причем в антигенном от- ношении пулы 4 ,и 5 почти не различа- . ются, При их анализ.е нммунофермент- ным методом с использованием сывороток .свиней с экспериментальным эхинококковом также показана наи большая

0

5

чувствительность (100%) и специфичность (92-94%) фракций 4 и 5, причем более специфична из них фракция 5 (94%).

Таким образом, результаты иммуно- ферментной реакции при эхинококкозе свиней показывают, что фракции, элю- ируемые при концентрации соли не выш 0,2 М, являются непригодными в качестве диагностикумов, тогда как фракции, элюируемые в диапазоне концентрации соли 0,2-0,4 М, обладают высокой чувствительностью и специфичностью, особенно фракция 5 (0,3-0,4 М)

Фракции 4 и 5, полученные при высоких концентрациях элюента (О, 2 - 0,4 М) при длительном хранении в замороженном состоянии устойчивы, не дают осадка и не теряют активности. Все 6 фракций испытаны при эхинококкозе свиней спустя 2 месяца после их получения. Следует отметить, что материал, из которого получены испытанные антигенные препараты, до очис

ки и на разных этапах очистки хранился в замороженном состоянии (-20 С) В целом в течение 2 лет.

Пример 2. Предварительные

30 ческого материала можно использовать, как и ранее, ступени градиента 0,3 М и 0,4 М.

Полученные в этом опыте фракции, соответствующие пикам оптической

и в примере 1, но при гель-фильтрации используют сефадекс Г-50.

Разбухший гель объемом 240 мл упаковывают в колонку (3 см X 50 см), уравновешивают ее пропусканием 0,01 М 35 или ступеням градиента, трис-НС1-буфера,содержащего 0,2 М ши объединены в 5 пулов (1-3, 4а, NaCI (рН 8,2), наносят 20 мл концен- пул бьш сконцентри- трата эхинококковой жидкости с содер- Д° такого объема, который имел жанием белка 15,5 мг/мл и элируют со образец до фракционирования, и под- скоростью 60 мл/ч. После выхода 80 мл 40 вергнут им унохимическому анализу в элюата включают коллектор и собирают реакции иммунодиффузии с фракции объемами по 7 мл. После сбора 30 фракций элюхщю прекращают, отбирают образцы элюата по 0,1 мл, разбавляют их в 3 мл воды и фотометрируют

использованием сьшороток людей, больных эхино- коккозом„ Иммуногенные для человека эхинококковые антигены обнаружень во g всех пулах, причем в некоторых пулах присутствуют как одинаковые, так и

при 280 нм. Результаты опыта выражают графически.

Фракции, соответствующие первому пику ( О до 0,35) и проявившие антигенную активность с образованием нескольких полос преципитации в реакции иммунодиффузии с сыворотками людей, больных.эхинококк03омj и с сьгеоболее близкими в антигенном отношешш оказались фракго и 46 и 5.

50

При анализе фракций в реакции иммунодиффузии с сывороткой кролика, содержащей антитела к глобулинам (преимущественно, к имм ноглобулироткой кролика, иммунизированного эхи-gg нам) овечьей сьшоротки, показано при- нококковой жидкостью, объединяют в сутогтвие иммуноглобулинов овцы во

один пул, объем которого составляет .фракциях, элюируемых при концентрации

около 50 МП. Остальные фракции отбра- соли до 0,25 М, то есть во фракциях сывают. .1-3 и 4 а. Во .фракциях 4б (0,25-0,30

363564Ь

Дальнейшую очистку антигенов проводят на анионообменнике ДЕАЕ-сефадек- се А-50 (объем геля в колонке 45 мл, образец 50 мл пула фракций, полученных на сефадексе Г-50).

В качестве стартового буфера используют 0,01 М трис-HCI с добавле- .нием 0,2 М NaCI, то есть берут такую

10 концентрацию, при которой, согласно примеру 1, элюируется фракция 3. Вместе с ней естественно будут элюи . рованы и фракции 1-2, что значительно сокращает объем работы.

15 В примере 1 было показано, что фракция 4, элюируемая в диапазоне 0,2-0,3 М, по специфичности в иммуно- ферментной реакции несколько уступает фракции 5 (0,3-0,4 М), хотя по

20 результатам иммунодиффузионного анализа обе фракции в антигенном отношении близки. По-видимому, более низкая специфичность фракц11и 4 обусловлена присутствием в ней компонентов 25 смежной, менее специфичной фракции (0,1-0,2 М), от которых можно освободиться, применив промежуточную ступень градиента концентрации соли, а именно 0,25 М. Для элюции специфи30 ческого материала можно использовать, как и ранее, ступени градиента 0,3 М и 0,4 М.

Полученные в этом опыте фракции, соответствующие пикам оптической

35 или ступеням градиента, ши объединены в 5 пулов (1-3, 4а, пул бьш сконцентри- Д° такого объема, который имел образец до фракционирования, и под- 40 вергнут им унохимическому анализу в реакции иммунодиффузии с 35 или ступеням градиента, ши объединены в 5 пулов (1-3, 4а, пул бьш сконцентри- Д° такого объема, который имел образец до фракционирования, и под- 40 вергнут им унохимическому анализу в реакции иммунодиффузии с

использованием сьшороток людей, больных эхино- коккозом„ Иммуногенные для человека эхинококковые антигены обнаружень во g всех пулах, причем в некоторых пулах присутствуют как одинаковые, так и

более близкими в антигенном отношешш оказались фракго и 46 и 5.

50

М) и 5 (0,30-0,40 М) они практически отсутствуют.

Диск-электрофорез в полиакриламид- ном геле показал, что основная масса сывороточного альбумина, присутствующего в овечьей эхинококковой жидкости, попадает во фракцию 4а (0,20- 0,25 М), ва фракции 46 обнаружены лишь его следы. Этот же метод показал практическое отсутствие во фракции 4б и глобулинов хозяина, присутствовав-ших в суммарной фракции 4 и оказавшихся после ее дополнительного разделения во фракции 4а.

Присутствие белков хозяина в антигенных препаратах может быть источником специфических реакций лри диагностике эхинококкоза с помощью имму- ноферментного метода, принцип которого основан на взаимодействии испытуемой сыворотки с антивидовым ко- нъюгатом. Как упоминалось в примере 1,, для получения антигенов используют жидкость из эхинококковых пузырей овец, в которой обычно присутствуют сывороточные белки овцы, Иммунохими- ческий анализ подтвердил их присутствие в концентрате эхинококковой жидкости и во фракцияхJ элюируемьк при концентрации соли до О,25 М.

Испытание фракции 5 (0,3-0,4 М) в качестве диагностикума в иммуно- ферментной реакции при эхинококкозе овец в контрольных опытах на возможность взаимодействия конъюгата с компонентами диагностического антигена (в отсутствии испытуемой сьшоротки) дало отрицательные результаты. Таким образом, показанное иммунодиффузион- ным методом отсутствие во фракции 5 белков овць1, с которыми мог бы взаимодействовать конъюгат, подтвержден иммуноферментным методом.

Испытания показали, что при эхинококкозе овец фракция 5 не уступает антигенам, полученным из эхинококког- вой жидкости человека и естественно не содержащим мешающих реакции имму- ноглобулинов овцы. Более того, она превосходит их по чувствительности. Если чувствительность цельной эхинококковой жидкости человека при эхинококкозе овец достигала 78,8%, а антигена, осажденного сернокислым аммонием из эхинококковой жидкости человека, 96,3%, то чувствительность фракции 5 была 100%-ной.

Q 5

п 5 Q

5

0

5

0

5

При необходимости адсорбцию антигенов на анионообменнике можно проводить без колонки, промывая носитель элюентом на фильтре.

Таким образом, наибол ее чувствительным и специфичным диагностикумом в иммуноферментной реакции при эхинококкозе является часть полученной путем гельфильтрации высокомолекулярной фракции эхинококковой жидкости, которая состоит из высокозаряженных компонентов и десорбируется с анионооб- менника в диапазоне концентрации соли 0,25-0,4 М.

Рекомендуемые согласно известному способу фракции, десорбируемью при концентрации элюента не выше 0,2 М, в иммуноферментной реакции обладают на 8-25% более низкой чувствительностью и на 4-6% более низкой специфичностью из-за присутствия белков хозяина и перекрестно-реагирующих антигенов паразитарного происхождения, устойчивые компоненты, обуславливающие неспецифичность фракций, элюируемьк при концентрации соли до 0,2 М, не способны обеспечить достаточную чувствительность этих фракций, что делает их в диагностическом отношении неперспективными.

Положительный эффект достигается тем, что антигенный препарат, полученный в диапазоне концентрации соли 0,25-0,40 М, обладает высокой устойчивостью. Он практически не теряет активности при хранении в замороженном состоянии до 2 лет (срок наблюдения). Кроме того, чувствительность эхинококковой жидкости человека при эхинококкозе овец достигает 78,8%, а антигена, осажденного сернокислым аммонием из эхинококковой жидкости человека, 96,3%, в то время как чувствительность данного диагностикума 100%.

В полученном данным способом препарате практически не содержится белков хозяина (овцы), поэтому он может быть примене н в качестве универсального диагностикума при эхинококкозе любых животных и человека.

Формула изобретения

Способ получения эхинококкового диагностического антигена для ферментного анализа, включающий сбор жидкости из эхинококковых пузырей зараженных овец, ее концент,рирование, замораживание - оттаивание и фракциоиирование комбинаций гель-фильтрации на сефадексе (от Г-50 до Г-200) и ионообменной хроматографии на ДЕАЕ- сефадексе , отличающий- с я тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности иммунного анализа, размороженный препарат центрифугируют, осадок отбрасьшают,

надосадочную жидкость фракционируют, ю 150000 концентраций соли 0,25-0,40 М.

Редактор Т.Пилипенко

Заказ 4908Тираж 644Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

- ---.. - .-. - -- - -- - --- .-.- -.-..- -- ...«...«-K.. W .- .™.™,..-.-,-.- .«,

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101

причем при гель-фильтрации собирают и объединяют все имм нологически активные фракции с коэффициентом распределения от О до 0,35, а при ионообменной хроматографии удаляют белки, элю- ируемые 0,25 М раствором соли, и за-, тем в препарат антигена объединяют фракции, элюируемые в интервале 750Составитель Л.Падюков

Техред Л.Олийнык Корректор В.Гирняк

Изобретение относится к ветеринарии, точнее к иммунологической диагностике лавральных форм гельминтов, а именно эхинококков. Цель изобретения - повьшение чувствительности и специфичности иммуноферментно- го анализа. Для этого неустойчивые компоненты эхинококковой жидкости Изобретение относится к ветеринарии, в частности к иммунологической диагностике лавральньк форм гельминтов, а именно эхинококков. Может быть использовано для той же цели в медицине при эхинококкозе человека. Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности иммуноферментного анализа. Пример 1. Проводят сбор жидкости из эхинококковых пузырей зараженных овец, затем проводят ее концентрирование в 60 раз (вначале на овец в процессе ее концентрирования, замораживания i и оттаивания, хранения при (-20°С) выпадают в осадок и удаляются центрифугированием, а устойчивые клетки, сохраняющие растворимость, освобождают от примеси компонентов невысокой молекулярной массы (Kq ОТ 0,35 до 1,0) гель-фильтрацией на сефадексё от 6-50 до 6-200. Из оставшихся высокомолекулярных фракций с КдуО-0,35 дополнительно удаляют неспецифические примеси на анионо- обменнике ДЕАЕ-сефадексе А-50 при концентрации злюента 0-0,25 М, затем элюируют специфический материал по- вьппением концентрации элюента с 0,25 до 0,40 М. Полученньй препарат не. содержит мешающих проведению иммуно- ферментной реакции перекрестно-реагирующих антигенов, может быть использован в качестве диагностикума при эхинококкозе сельскохозяйственных животных и человека. с (Л лиофильной установке до 10-кратного уменьшения объема, а затем в целлофане против сухого полиэтиленгликоля с молекулярной массой 40000). Полученный концентрат замораживают и хранят до использования при -20 С. В процессе концентрирования и хранения некоторые неустойчивые компоненты эхинококковой жидкости денатурируются и вьшадают в осадок. После размораживания концентрат центрифугируют в течение 15 мин при 10000 об/мин, осадок отбрасывают, а супернатант фракционируют на колонке (3 см х 80 см) с со Ф 00 СП Од 4