Способ получения фруктозодифосфатальдолазы Советский патент 1988 года по МПК C12P21/00 

Изобретение относится к энзимоло- гии, а именно к выделению ферментов, и может быть использовано в научной к лабораторной практике для изучения роли фруктозодифосфатальдолазы в иммунитете при холереJ а также использование как возможного ко.тонента :противохолерной вакциныо i Цель изобретения - повышение сте- |пени очистки,

I Пример. Культуру холерных |вибрионов классического биовара, сер iBapa Инаба, штамм 569В выращивают в течение 8-10 ч в 250-литровом ре- акторе-ферментере в условиях аэрации при 34-36 С глубиннь м методом на бульоне из ферментативного гидроли- зата кд:зеина рН 8,0, содержащего 200 мг% аминного азота 2% пептона, 0,5% NaCl, 0, 2-замещенного фосфата натрия Культивирование вибрионов пр.одолжают до концентрации 155-65 млрд, микробных клеток в, 1 мл |(в соответствии с регламентом произ- |водства холерной вакцины Холероген- натоксин + О - антиген), переносят всидкую реакторную культуру в объеме |2з5 л в стеклянную бутыль, емкостью Зли помещают в низкотемпературный колодильник для замораживания. Заме- заживание проводят при -25°С в тече ние 48 ч (в низкотемпературном холо- ,щльнике Грюнланд ГДР, модель 1-12,5/0,1), оттаивание при комнат- |ной температзфе в течение 30 ч. Пос- |ie окончания шестикратного цикла за- Ьюраживания-оттайвания и постановки гестов на жизнеспособность вибрионов Ьультуральную ЖРЩКОСТЬ центрифугиру- tor с целью вьщеления вибрионов из Ьреды при 6000g в течение 30 мин на Центрифуге ЦЛР-1 Надосадок отбрас№ бают, осадок клеток в объеме 120 мл йереносят в фарфоровую ступку, соединяют с равным объемом стеклянного йеска и растирают в течение 20 мин, Йо окончании процедлэы в ступку вносят рабочий буфер (0,005М.трис-НС1« :рН 7,6) в объеме 240 мл перемешиваю дают стеклянному песку осесть и над осадочную жидкость (360 мл) перенося :Ь центрифужные стака1ли Клеточный экстракт центрнф5пгируют при 6000g в течение 30 мин для удаления фрагментов разрушенных клеток. После центри фугирования надосадок в объеме 350 мл йереносят в колбу, осадок, состоящий тз разрушенных клеток вибрионов, от

..

0

0

5

брасывают. Бесклеточный экстракт насыщают сернокислым аммонием вначале до 30% путем внесения в колбу с экстрактом сухой сот.и из расчета 180 г/л, растворяют перемешиванием и центрифугируют для отделения образовавшегося осадка при 6000g в течение 20 мин. После этого надосадочную жидкость (350 мл) переносят в колбу (осадок 40 мл,, содержащий балластные вещества, отбрасывают) и вновь насыщают сульфатом аммония до 100% (от 30 до 100%) из расчета 510 г/л, растворяют C внесенную соль (178,5 г) перемещива- нием и центрифугируют с целью отделения осадка при 6000g в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок в объеме 30 мл, содержащий фермент, помещают в диализатор и диализуют против рабочего, буфера в течение 24 ч. При обессоливании происходит увеличение объема содержимого диализатора за счет гидрофильных свойств белка до 130 мл. По окончании диализа препарат фильтруют через бумажный фильтр (для удаления крупных частиц) и наносят на колонку размером 2,5-50 см с ДЭАЭ-целлгало- зой, уравновешенной рабочим буфером Сорбцию ферментсодержащего белка на целлюлозу проводят со скоростью 40 мл/л, Элюцию осуществляют в объеме 1 л 0,5М NaCl в рабочем буфере со , скоростью 20 мл/ч. Фракции собирают на автоматическом коллекторе фракций ХКОВ-1 по 5 мл в пробирку. Полученные порции элюата спектрофотометрируют при 280 нм на СФ-26, по полученным данным строят хроматографический про0

5

0

филь. Полученные 5 пиков изучают

на ферментативную активность. Фруктоз одифосфатальдолазной активностью обладают четвертый и, пятый пики. Наиболее активные порции (четвертьй и пятый пики) объединяют и изучают на антигенные и иммуногенные свойства.

Таким образом, способ позволяет повысить степень очистки более, чем в 3 раза.

Формула изобретения

Способ получения фруктозодифосфатальдолазы путем экстракции сырья, фракционирования сульфатом аммония, ионообменной хроматографией, о т л и,31423551

чающийся тем, что, с цельюбуфером рН 7,6, центрифугируют, фрак- повышения степени очистки, холерныеционируют дробно сернокислым аммони- вибрионы инактивируют шестикратнымем, осадок растворяют, и диализуют замораживанием - оттаиванием, центри-против 0,005 М трис-НС1-буфера рН 7,6 фугируют, клетки механически дезин-и очищают на ДЭАЭ-целлюпозе при элю- тегрируют со стеклянным песком, экст-ации линейным градиентом 0,5 М хло- рагируют гомогенат 0,005 М трис-НС1-ристого натрия рН 7,6,

Изобретение относится к энзимологии, точнее к вьзделению ферментов, и предназначено для научной и лабораторной практики при изучении роли фруктозодифосфатальдолазы в иммунитете при холере и для использования фруктозодифосфатальдолазы как возможного компонента противохолерной вакцины. Цель изобретения - повьш1ение степени очистки. Для этого холерные вибрионы инактивируют 6-кратным замораживанием-оттаиванием, центрифугируют. Проводят механическую дезинтеграцию клеток со стеклянным песком, экстрагируют гомогенат 0,005 М трис- НС1-буфером рН 7,6, снова центрифугируют. Затем проводят дробное фракционирование, осадок растворяют и диали- зуют против 0,005 М трис-НС1-буфера рН 7,6, проводят ионообменную хроматографию - очистку на ДЭАЭ-целлкшозе при элюции линейным градиентом 0,5 М NaCl рН 7,6, Полученные порции элюата спектрофотометрируют при А 280 нм и строят хроматографический профиль. Полученные 5 пиков излучают на ферментативную актцрность. Фруктозоди- фосфатальдолазной активностью обла- . дают 4-й и 5-й пики, которые объединяют и изучают на антигенные и имму- ногенные свойства. (/)