Способ получения фосфодиэстераз Советский патент 1980 года по МПК C07K1/14 A61K35/60 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается получения биологически активных веществ, которые могут найти применение в метицине в качестве терапевтических средств. Известен способ получения фосфоди- эстераз путем гомогенизации исходного сырья с последующим отстаиванием гомр гената, декантированием образовавшейся надосадочной жидкости, сбдержашей ферментный белок, и высаливанием целевого продукта сульфатом аммония i Однако фермент, полученной данным способом, обладает недостаточной активностью. Целью изобретения является повышение активности ферментов и.расширение сырьевой базы. Эта цель достигается тем, что в качестве сырья используют отходы внутрен них органов рыб, а высаливание целевого продукта ведут при концентрации сульфата аммония 30-80%. П р ИМ ,е р 1. Получение 5 -фосфодиэстеразы .из внутренних органов карпа. Внутренние органы рыб, включающие печень, кишечник, сердце, селезенку, молоки и т. п.., используют сразу же после извлечения из рыб или хранят в замороженном виде до употребления (вплоть до 6 мес. без потерибиологической активности) . Все операции по выделению В-фосфойиэстеразы проводят на холоду при 0-4°С.. . юр г свежепблученнбй (или замороженной) ткани внутренних органов, рыб измельчают в гомогенизаторе (например марки PT-l; 2ООО об/мин; 3 мин) в 150 мл холодной дистиллированной воды. После измельчения ткани добавляют еще 150 мл дистиллированной воды и по каплям вводят 0,4 М серную кислоту (25 мл) до конечной концентрации ее . & растзоре 0,025 .М. При этом рН гомогената снижается до 3. Экстракцию ферментных белков осуществляют встрякиван.ием гомог ената с кислотой в течение

4- ч на механической качалке, либо отстаиванием его в течение 3-к сут при 2-4 С, Выход ферментных белков при двух способах экстракции одинаков, но фосфодиэстеразная активность в первом случае выше. В ходе экстракции в описанных условиях (рН 3; 0,025 М серной кислоты; температура О-4 С) резко снижается активность фосфомоноэстеразы и происходит денатурация сопутствующих (балластных) белков, что способствует очистке целевого Продукта.

После окончания экстракции гомоге- нат центрифугируют (например на центрифуге ЦЛР-1 при 2500 об/мин, ЗО мин) или фильтруют на воронк Бюхнера для удаления обрывков ткани, субклеточных структур и денатурированных белков. Осадок отбрасывают, а из прозрачной надосадочной жидкости проводят дробное фракционирование (высаливание) белков сернокислым аммонием. Высаливание проводят на холоду (), постоянно перемешивая раствор и добавляя соотвегствуг

ющее количество сухого сернокислого аммония. Определение гранид высаливания белков, обладающих фосфодиэстераз- ной активностью, показывает, что они содержатся во фракции, полученной при насыщении надосадочной жидкости от ЗО% до 80%.

Полученный белковый осадок растворяют в минимальном количестве холодной дистиллированной воры (3-6 мл) и обессоливают известным способом, например диализом или гельфильтрацией на колонке, содержащей сефадекс Г-25 или биогель Р-2 или биогель Р-6.

Обессоленный раствор фосфодиэстераз хранят в замороженном виде (6 мес без потери биологической активности) или сразу используют для гидролиза ДНК.

В табл. 1 показано выделение препарата 5 -фосфодиэстераз из 10О г внут- ренних органов рыб, например карпа C jprinus CdrpioU.

2607280438,6

Гомогенат после центрифугирования

56

50206253,4

Как видно из табл. 1, выделение 5 « осфодиэстеразы предламемым способом включает в себя две стадии работы (требующие всего 1-3 дн. для завершения) и дает высокий выход целевого продукта, удельная активность которого по вышена в 20 раз по сравнению с исходной.

Таблица 1

6О

100

(28 Kir/мл)

О

О

зоо

(5,4 мг/мл)

58

1230

(4,1 мг/мл)

Аналогичные результаты получены при выделении 5 -фосфодиэстеразы из 5 кг внутренних органов рыбы при соответствующем увеличении всех объемов рабочих растворов.

Пример 2. Получение з-фосфодиэстеразы из внутренних органов карпа. Все операции по выделению з-ч}юсфоднэстеразы проводят на холоду при 0-4 С. 100 Гвнутренних органов рыб (свежеполученных или хранившихся замороженными) гомогенизируют, затем проводят водно-кислотную экстракцию белков из гомогената при рН 3 с последующим высаливанием сульфатом аммония белков, обладающих 3 -фосфодиэкстеразной активностью (30% - 80% насыщения). Полученный после центрифугирования 36 белковый осадок растворяют ЕЬ минимпльном количестве (5-7 мл) холодной дистиллированной воды, обессоливают и хранят в замороженном виде (4-5 мес без потери биологической активности) или сразу используют для гидролиза ДНК. В табл. 2 показано выделение препарата з-фосфодиэстеразы из 10О г внутренних органов рыб, например кар аа СарИо L. Таблица 2