СПОСОБ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ИЗ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ РЫБ Российский патент 1996 года по МПК C12N9/50 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу извлечения ферментного препарата из мышечной ткани сельди тихоокеанской, карпа, минтая, сельди иваси разных размерных групп и может быть использовано в рыбной и мясной отраслях пищевой промышленности для технологических и исследовательских целей, в биотехнологии и медицине.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ извлечения мышечного ферментного препарата, содержащего катепсины из лосося, включающий гомогенизацию ткани с двумя частями 0,2 N раствора КСl в гомогенизаторе в течение трех мин при 3 ^oС, центрифугировании гомогената при 34000 g в течение 20 мин при 3 ^oС, очистку осаждением балластных белков 0,5 N НСl (рН 5,5), отстаивание 10 мин центрифугирование при 1000 g в течение 20 мин, нейтрализацию 0,5 N раствором NaOH до первоначального рН, равного 6,5, добавление воды для стандартизации объема, диализ раствора в 0,005 N фосфатном буфере (рН 6,5) при 3 ^oС, отделение осадка центрифугированием при 1000 g в течение 20 мин при 3 ^oС, концентрирование активного белка путем фракционирования сульфатом аммония при насыщении от 0,25 до 0,50 при 3 ^oС, отделение осадка центрифугированием при 34000 g в течение 10 мин при 3 ^oС, растворение осадка в минимальном количестве 0,005 N фосфатного буфера (рН 6,5), диализ раствора в том же буфере в течение 12 ч, отделение осадка центрифугированием при 34000 g в течение 10 мин при 3 ^oС, ионно-обменная хроматография фермента в супернатанте на ОЭАЭ-целлюлозе, сбор фракций, выходящих с колонки, концентрирование собранных фракций лиофилизацией, растворение лиофилизованных фракций в минимальном количестве воды, диализ раствора против исходного буфера в течение 24 ч при 3 ^oС, отделение осадка центрифугированием при 1000 g в течение 10 мин при 3 ^oС и определение в супернатантах величины активности фермента в кислой зоне рН-оптимума.

Суммарный выход по активному белку составляет 24%
Недостатками известного способа являются низкая степень извлечения фермента, многостадийность процесса, привлечение дополнительных реагентов.

Целью изобретения является повышение выхода ферментного препарата, упрощение процесса.

Это решается способом извлечения мышечного ферментного препарата, содержащего катепсины рыб, включающим гомогенизацию мышечной ткани рыбы в 0,07-0,15 N растворе КСl при объемном соотношении ткани и раствора, равном 1:1-1,5, экстракцию фермента при массовом соотношении ткани и 0,07- 0,15 N раствора КСl, равном 1:3-4, отделение осадка центрифугированием при 18000-24000 g афинную хроматографию на грамицидин-с-силохроме или бацитрацин-силохроме при рН 5,0-6,5, диализ ферментного раствора в 0,007-0,015 N растворе КСl и последующую афинную хроматографию на грамицидин-с-силохроме при рН 5-6,5, сбор элюируемых фракций, обессоливание в дистиллированной воде и лиофильную сушку. Все операции проводят при 0-4 ^oС.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что гомогенизацию мышечной ткани проводят в 0,07-0,15 N растворе КСl при объемном соотношении ткани и раствора 1:1-1,5, экстракцию фермента проводят 0,07-0,15 N раствором КСд при массовом соотношении ткани и раствора 1:3-4 очистку экстракта фермента проводят афинной хроматографией двухступенчато при рН 5,0-6,5 с промежуточным диализом в 0,007-0,015 N растворе КСl.

Пример 1. 17,5 г белой мышечной ткани измельчают в гомогенизаторе РТ-2 в течение 2 мин при 4 ^oС и объемном соотношении ткани и раствора 0,07 N КСl, равном 1:1, ведут экстракцию фермента в этом же растворе при массовом соотношении ткани и раствора, равном 1:3 в течение 2,5 ч при перемешивании и 4 ^oС. Все последующие операции проводят при этой же температуре. Полученный гомогенат центрифугируют при 18000 g в течение 20 мин и супернатант в количестве 50 мл наносят на колонку с грамицидин-с-силохромом, уравновешанную 0,1 М ацетатным буфером (рН 6,5) и после контакта с сорбентом ферментный раствор диализуют в 0,07 N растворе КСl в течение 24 ч. 25 мл диализованного раствора наносят на вторую колонку с грамацидин-с-силохромом, уравновешанную тем же буфером, собирают элюируемые фракции, содержащие катепсины.

Ферменты в кислой зоне рН-оптимума обессоливают диализом в дистилированной воде в течение 12 ч при двукратной смене воды и лиофильно высушивают препарат для хранения.

Суммарный выход конечного продукта по активному белку составляет 41%
Пример 2. 7 г белой мышечной ткани рыбы гомогенизируют на средней скорости в гомогенизаторе РТ-2 в течение 1 мин при 4 ^oС и объемном соотношении ткани и 0,15 N раствора КСl, равном 1:1, экстрагируют фермент в этом же растворе при массовом соотношении ткани и раствора, равном 1:4, в течение 2,5 ч при перемешивании и 4 ^oС. Все последующие операции проводят при такой же температуре. Полученный гомогенат центрифугируют при 18000 g в течение 20 мин и супернатант наносят на колонку с бациллихин-силохромом, уравновешанную 0,1 М ацетатным буфером (рН 6,5). После прохождения через колонку с сорбентом ферментный раствор диализуют в 0,07 N растворе КСl в течение 24 ч. 3,5 мл диализованного раствора наносят на колонку с грамицидин-с-силохромом, уравновешанную тем же буфером, определяют величину активности и концентрацию белка в суммарной фракции элюата в кислой зоне рН-оптимума фермента, обессоливают гельхроматографией на колонке с сефадексом С-25 и лиофильно высушивают препарат.

Выход конечного продукта у полученного препарата по активному белку составляет 60%
Изобретение позволяет значительно повысить выход конечного продукта по сравнению с прототипом, а также уменьшить число стадий процесса во избежание инактивации фермента, проводить обессоливание ферментного раствора методом гель-фильтрации через сефадекс С-25, исключить использование реагентов НСl и (NH₄)₂SO₄.

Использование: изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу извлечения ферментного препарата из мышечной ткани сельди тихоокеанской, карпа, минтая и может быть использовано в рыбной и мясной промышленности, в биотехнологии и медицине. Сущность изобретения заключается в том, что для повышения выхода ферментного препарата и упрощения процесса осуществляют гомогенизацию мышечной ткани в 0,07-0,15 N растворе КСl при объемном соотношении ткани и раствора 1:1-1,5 и температуре 0-4 ^oС, экстракцию гомогената 0,07-0,15 N раствором КСl с последующим отделением полученного осадка, очистку фермента от балластных белков афинной хроматографией с промежуточным диализом и лиофильную сушку.

Способ извлечения ферментного препарата из мышечной ткани рыб, включающий гомогенизацию мышечной ткани, отделение полученного осадка центрифугированием, очистку фермента от балластных белков хроматографией, очистку диализом и лиофильную сушку, отличающийся тем, что гомогенизацию мышечной ткани проводят в 0,07 0,15 N растворе KСl при объемном соотношении ткани и раствора 1 1 1,5 и температуре 0 4^oС, после чего фермент экстрагируют 0,07 0,15 N раствором KCl при массовом соотношении ткани и раствора 1 3 4, а очистку фермента от балластных белков проводят афинной хроматографией двухступенчато при pH 5,0 6,5, при этом диализ осуществляют в 0,007 0,015 N растворе KCl между ступенями афинной хроматографии.