Способ получения пероксидазы Советский патент 1984 года по МПК C12N9/08 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано длд промышленного и лабораторного получения пероксидаэы Известны различные способы получения пероксидазы из корней хрена СИ и С 21 . Однако они не обеспечивают доста точно высоких выхода и активности фермента в силу длительности и многостадийнрсти процесса выделения. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстрак цию фермента водой, фракционировани .экстракта сульфатом аммония и его гель-фильтрацию С21. Однако способ характеризуется недостаточно высоким выходом фермен га (удельная активность 11§0 1340 Е/мг белка). Целью изобретения является увеличение выхода и активности перокси дазы. Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения пероксидазы, включающему гомогенизацию растительной ткани, экстракцию фермента, фракционирование экстракта сульфатом аммония и его гель-фильтрацию, в качестве растительной ткани используют листья полыни, для экстракции используют водный раствор, содержащий NaCl в концентрации 0,490,51М, и аскорбат натрия в концентрации 0,029-0,031 М, а после гельфильтрации проводят ионообменную хроматографию на карбометилцеллюлозе или диэтиламиноэтилцеллюлозе. С целью увеличения выхода фермента в воду при экстракции добавляют NaCl (0,49-0,51 М), для предотвращения окислительного действия фенольных соединений добавляют аскорбат натрия (0,025-0,031 М). Это позволяет значительно повысить выход целевого продукта. Пример. 70 г листьев полыни гомогенизируют в дистиллированной воде с 0,5 М NaCl и отжимают через ткань. Балластные белки осаждают сульфатом аммония до 30%-ного насыщения. Осадок отбрасывают, а в надосадочную жидкость добавляют сульфат аммония до 80%-ного насыщения. Осадок отделяют центрифугированием, перерастворяют в ацетатном буфере (0,005 М, рН 4,4) и пропускают через колонку с G-50. Затем проводят очистку на колонке с КМ-целлюлозой, Результаты выделения фермента представлены в таблице.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ, включающий гомогенизацию растительной ткани, экстракцию фермента, фракционирование экстракта сульфатом аммония и его гель-фильтрацию, .отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода фермента, в качестве растительной ткани используют листья полыни, для экстракции используют водный раствор, -содержащий NaCl в концентрации 0,490,51 М, и аскорбат натрия в концентрации. 0,029-0,031 М, а после гельфильтрации проводят ионообменную хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе. или диэтиламиноэтилцеллюлозе.

18

200 94,5

70

После

1 Пример 2.70 г полыни гомоге.визируют Б дистиллированной воде с NaCl (0,45 М). Для осаждения балластных белков проводят высаливание балластных белков сульфатом аммония до 20%-ного насыщения. Осадок отбрасывают, а в надосадочную жидкость добавляют сульфат аммония до 80%-ного насыщения.

Осадок отделяют центрифугировани,ем, перерастворяют в ацетатном буферё (0,005 М, рН 4,4) и пропускают

20,1 94,8

4,7

через колонку с G-50. Фракции, проявляющие пероксидную активность, очищают на КМ-целлюлозе. Общий выход фермента 1,9 мг с активностью 2600 мкмоль/мин на 1 мг фермента.

ПримерЗ. 45 г полыни гомогенизируют в дистиллированной воде с 0,55 М NaCl. После удаления балластных белков, осаждаемых при 20%-ном насыщении сульфатом аммония, :проводят высаливание при 80%-ном на:сыщении. Осадок отделяют центрифугированием и перерастворяют в 0,005 М ацетатном буфере (рН 4,4). Предварительно обессоленный белок на колонке с G-50 пропускают через колонку с КМ-целлюлозой. Общий йыход белка 14,3 мг с активностью 1200 мкмоль/ми на 1 мг фермента. Пример 4, 1г листьев полыни гомогенизируют в дистиллированной воде с 0,029 М аскорбата натрия. Гомогенат фильтруют и пропускают через колонку с сефадексом G-50. Получают частично очищенный ферментный препарат с активностью 372 мкмоль/мин на 1 мг белка с общим выходом белка 2,5 мг. ПримерЗ. 1г листьев полыни гомогенизируют в дистиллированной воде. Гомогенат фильтруют и пропуст кают через колонку с G-50. Получают частично очищенный ферментный препарат с активностью 226 мкмоль/мин на 1 мг белка с общим выходом белка 2,5 мг. . 70г полыни гомогенизируют в дистиллированной воде с 0,51 М NaCl и 0,03 М аскорбата натрия. Гомогенат фильтруют и удаляют балластные белки высаливанием сульфатом аммония до 30%-ного насыщения. Супернатант высаливают суль- . фатом аммония до 80%-ного насьпцения. Полученный осадок перерастворяют в 0,005 М ацетатном буфере (рН 7,7) и наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Пероксидаза злюируется с колонки при концентрации NaCl 0,5 М. Выход белка 15 мг с удельнойактивностью 1314 мкмоль/мин на 1 мг белка. Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение фермента пероксидазы с высокими выходом и удельной активностью из доступного и дешевого сырья.