Способ выделения комплекса протеолитических ферментов из поджелудочной железы китов Советский патент 1982 года по МПК C12N9/64 

(5) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КИТОВ

Изобретение относится к технологии получения протеолитических ферментов и может быть использовано в ферментной промышленности, а получаемый препарат - в медицине, пищевой промышленности.

Известен способ получения комплекса протеолитических ферментов из морепродуктов - гепатопанкреаса промысловых видов крабов, включающий гомогенизйцию сырья в воде, отстаивание гомогената, очистку полученной жидкой фазы от примесей путем введения сульфата аммония до насыщения 0,3 отде- jj ление осадка, фильтрацию, осаждение ферментов в фильтрате сульфатом аммония до насыщения 0,8, растворение осадка с комплексом ферментов в дистиллированной воде, диализ и лиофили-20 зацию целевого препарата. Способ обеспечивает получение комплекса ферментов, содержащего трипсин, химотрипсин, карбоксипептидазы А и Б, лейцинаминопептидазу, щелочные и нейтральные протеазы .

Однако указанный способ обладает тем недостатком, что использование в качестве сырья для получения ферментов промысловых видов крабов нерентабельно из-за дефицитности этих видов. Способ включает много стадий выделения, что обуславливает длительность очистки целевого продукта и сказь1вается на его себестоимости.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ выделения комплекса протеолитических ферментов из поджелудочной железы китов, предусматривающий гомогенизацию поджелудочной железы, дробную экстракцию 2 объемами и 1объемомО,25 N, раствора серной кислоты, доведение рН экстракта до 3,0, двухстадийное осаждение ферментов сульфатом аммония до 20 и 0% насыщения. Фракцию, осажденную между 20 и 0 насыщения, растворяют в 10 объемах 0,1 М боратного 3, 98 буфера, добавляют 0,1 М раствор хлористого кальция и активируют трипсином при +5С, Ферментный препарат диализируют против 0,001 N. раствора соляной, кислоты на холоду, центрифугируют и сушат лиофилизацией. Выход протерлитического комплекса из 1 кг поджелудочной железы кита составляет 1,8 г (по белку) 2. Известный способ характеризуется недостаточно высоким выходом и активностью ферментов, а также многостадий ностью процесса, за счет чего снижает ся выход ферментов и их активность. Целью изобретения является повышение выхода и активности ферментного комплекса при упрощении технологии, устранении кислотной экстракции, кото рая является основной причиной снижения активности. Поставленная цель достигается тем что согласно способу выделения комплекса протеояитических ферментов из поджелудочной железы китов, включающему гомогенизацию сырья, экстракцию осаждение ферментов, активацию комплекса трипсином и сушку, экстракцию и активацию комплекса ферментов осуществляют одновременно в буфере рН 7,6-8,0, а трипсин используют в количестве 4-6 мг на 100 г гомогената, осаждение ферментов осуществляют ацетоном с отделением полученного осадка центрифугированием. Обычно отделение осадка центрифугирован1 м осуществляют при 6- тыс. об/мин, а сушку целевого продукта осу ществляют при 20-2S C. За счет предлагаемой совокупности условий обработки поджелудочной железы китов способ обеспечивает получение комплексного ферментного препарата с высоким выходом - 10-11 г белка из 1 кг сырья, а казеинолитической активностью порядка 50 и эстеразной 70-80% от исходной. П р и м е р 1. 1 кг замороженной поджелудочной железы китов оттаивают в течение 1,5 ч, измельчают резекционным ножом и дважды гомогенизируют при пропускании через мясорубку с диаметром отверстий 2-3 мм. К полученному гомогенату добавляют 3 л экстрагента: 0,05 М трис-НС1-буфера рН8,0 содержащего 0,025 М хлористый кальций и 60 мг активатора - кристаллического трипсина из поджелудочной железы крупного рогатогоскота. Смесь оставляют для активации на 2k ч при +2+k С, центрифугируют при 7 тыс. об/мин в течение kQ мин при и нерастворившуюся часть отбрасывают. К 3 л прозрачного раствора добавляют 6 л ацетона, предварительно охлажденного до , при быстром перемешивании. Через 30 мин осадок отделяют от раствора декантацией и центрифугированием при 6 тыс. об/мин при +2°С в течение 15 мин. Осадок целевого продукта сушат при , удаляя следы ацетрна. Из 1 кг поджелудочной железы кита получают 11,2 г белка. Удельная активность ферментного препарата, выраженная в ед./мг белка, составляет: 2б22 (субстрат-N-бeнзoил-Z-тирозин-метиловый эфир), 410 (субстрат-М-бензоил-Z-аргинин-этиловый эфир), 4,8 (субстрат казеина). Выход по казеинолитической активности составляет 50°, по эстеразнойПример2. 10 кг замороженной поджелудочной железы китов оттаивают в течение 2 ч, измельчают и гомогенизируют. К гомогенату добавляют 30л экстрагента до рН 7,6 и 500 мг активатора - кристаллического бычьего три псина. Смесь оставляют для активации на 24 ч при +2 С и перемешивании. Смесь центрифугируют при 6,5 тыс. об/мин, к надосадочной жидкости добавляют 50 л ацетона охлажденного до -20°С. Через 60 мин осадок ферметов отделяют от раствора декантацией и центрифугированием при 7 тыс. об/мин при +4°С в течение 20 мин. Осадок целевого продукта сушат при . Из 10 кг поджелудочной железы китов получают 108 г ферментного препарата. Выход по казеинолитической активности составляет 55, по эстеразной - 75%Комплекс протеолитических ферментов из поджелудочной железы китов содержит кроме трипсин- и химотрипсинподобных протеиназ (субстраты - казеин - рН 7,8/4,8 ед/мг белка); БАЭЭ-N-бензоил-2-аргинин-этиловый эфир (410 ед/мг белка); БTMЭ-N-бeнзoил-Z-тирозин-метиловый эфир (2622 ед/мг белка нейтральные протеиназы ( рНб,0), в составе которых могут проявляться трипсин и химотрипсин (субстрат гемоглобин - ед/мг белка); кислые протеиназы - субстрат гемоглобин (рН ) - 1,76 ед/мг белка; пепсиноподобные

протеиназы - субстрат-М-карбобензокси-о1-7-глутамин-1-тирозин 337 ед/мг белка); аминопептидазы - субстрат лейцил-глицил-глицин (k2 ед/мг белка); карбоксипептидазы - субстрат-N-карбо- s бензокси-глицил-2-лейцин (53 ед/мг белка).

Результаты испытаний активности ферментного препарата, полученного предлагаемым и известным способами, 10 приведены в таблице,

Технико-экономическая эффектив ность изобретения заключается в том, что за

счет предлагаемой совокупности условий выход комплексного протеолитического препарата из поджелудочной железы китов увеличивается в 3 раза.

Ферментный препарат при сушке практически не теряет казеинолитическую активность.

Предлагаемый способ отличается простотой, он позволяет при использовании небольшого количества этапов получить протеолитический комплекс, обладающий ценным набором ферментов, что особенно эффективно при использовании их в практике.

15

Предлагае