Способ получения дезоксирибомононуклеотидов Советский патент 1976 года по МПК A61K38/16 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОМОНОНУКЛЕОТИДОВ

1

Изобретение относится к получению биологически активных веществ которые могут найти применение в медицине в качестве физиологически активных средств.

Известен способ получения мононукпеотидов ферментативным путем, например, при обработке РНК культуральной жнцкостью штаммы StoiplrvLococcus aurcus в условиях пониженной активности, содержащейся в среде фосфотазы.

Известен также способ получения 5-мононуклеотидов, заключающийся в ток, что в качестве сырья испат:ьзуют полимерные нуклеиновые кислоты, которые расщепляют на мононуклеотиды 5-фосфодиэстераза ак- тивными экстрактами растительного происхождения с последующим выделением целевого продукта известными приемами,

Однако известные способы не обеспечивают высокого выхода целевого продук- та,

С целью расширения сырьевой базы и повышения выхода целевого продукта в предлагаемом способе в качестве исходного сырья используют отходы производ2

ства протаминсульфата из молок рыб, экстракцию осуществляют кислотой, а фер ментативный гидролиз проводят нуклеазами из печени промысловых рыб.

Для получения дезоксирибомононуклеотидов предлагаемым способом применяют ферментные препараты, которые получают из печени морских промысловых рыб, таки как камбала, горбуша и . Получают их следующим образом.

Печень камбачы гомогенизируют в дистиллированной воде, подкисленной до рН 3,0 в гомогенизаторе Уоринга, затем гомогенат экстрагируют в течение 3 суток, освобождают от.верхнего слоя жира, после чего центрифугируют при 4°С и 250О об/мин в течение 40 мин, Затем надосадочную жидкость сливают и доводят добавлением сухого сернокислого аммония до 25% насыщения. Осадок отделяют центрифугированием, а надосадочную жидкость доводят до 9О% насыщения. Осадок собирают фильтрованием и растворяют в минимальном объеме дистиллированной воды. Полученный раствор снова доводят до н сыщения 40%-ным сернокислым аммонием затем осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают, Надосадочную жидкость доводят до 90% насыщения сернокислым аммонием, затем выпавший в осадок собирают фильтрованием под вакуумом. Полученный осадок растворяют в минимальном количестве 0,01М фосфатного буфера, рН 8,0 и в таком .виде полученный препарат хранят в течение при без потери активности. Дальнейшую очистку ферментного препарата осуществляют с помощью гельфильтрации на колонке с сефадексом 6-100, После очистки ферментного препарата про водят фракционирование на колонке с ДЕА целлюлозой и собирают объединенные фракции фосфодиэстеразы, дезоксирибонуклеазы 1 и Ц. Дезоксирибомононуклеотиды из отходов производства протаминсульфата из молок рыб получают следующим образом. Пример Отходы производства про таминсульфата из молок рыб растирают до порошкообразного состояния в фарфоровых ступках. Затем полученную порошкообразную массу (250 г) перемешивают в 5 л 7%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХ полученный раствор разливают по 1 л -в колбы и встряхивают на универсальном аппарате для встряхивания жидкости до 4 О мин, затем центрифугируют 20 мин при 500О об/мин, удаляют осадок, а над осадочную жидкость сливайт в стеклянную емкость. Таким образом извлекают кислоторастворимые продукты - алигонуклеотиды, мононуклеотиды, азотистые основания. Полученный кислотный экстракт нейтрализуют 4н, аммиаком до рН 7,0 добавл5пот 4 г МсгбОд. , затем вносят препарат нуклеаз {4ОО мг), выделенный вышеописанным способом. Реакционный раствор инкубируют при 37 °С в течение 24 час, рН инкубационной смеси периодически контролируют. После окончания процесса ферментатив ного гидролиза олигонуклеотидов и добавления 1О л 96° гидролизного спирта, полученный раствор фильтруют, затем упаривают до сиропообразной жидкости, кото рую разводят дистиллированной водой и фильтруют через активированный угсиь для удаления пигментов. Разделение смеси дезоксирибомононуклеотидов осуществляют следующим образом. Берут 1ОО мл раствора смеси дезокси рибомононуклеотидов и наносят на ионообменную колонку размером 50x12 см. содержащую смолу Дауэкс- в. хлоридной форме, рН наносимого раствора предварительно доводят аммиаком до 10, Сначала колонку промывают бидистиллированной водой для удаления аммиака, раствором OjOlM хлорида аммония 1215 л, до тех. пор, пока рН эпюирующего раствора не понизится до 7,0, В результате такой промывки удаляют .азотистые основания и нуклеозиды, после этого колонку промывают 0,01М соляной кислотой (15-20 л), при этом удаляют все нуклеотрады. ПолинукЛеотиды и остатки негидролизовавшейся ДНК остаются на колонке, Так осуществляют первоначальное разделение продуктов гидролиза ДНК Затем фракцию дезоксирибомононуклеотидов, полученную при пропускании через колонку 0,О1М раствора соляной кислоты и концентрированную повторной реабсорбцией на Дауэкс-1, подщелачивают BOftным раствором аммиака и наносят на колонку меньших размеров (10x2 см), содержащую Дауэкс-1, для выделения О-Рдельных дезоксирибонуклеотидов, осуществляя их фракционирование следующим образом. Пропускают О,01М раствор хлористого аммония до тех пор, пока рН раствора, вытекающего из колонки,не снизится до 6,0, затем пропускают через колонку 0,О01 М раствор соляной кислоты,при этом выделяют фракцию, содержащую дезоксицитидиловую кислоту (включая 5-метилдитидиловую кислоту), затем гфомыванием 0,002М соляной кислотой выделяют фракцию, содержащую дезоксиадениловую кислоту, раствором 0,ООЗМ соляной кислоты выделяют фракцию, содержащую тимидиловую кислоту, раствором 0,005М соляной кислоты выделяют фракцию, содержащую дезоксигуаниловую кислоту, Идентификацию фракпкк нуклеотидов, собранных с колонки, осуществляют при помощи спектр офотометрии. Полученные растворы дезоксирибомононуклеотидов каждый в отдельности концентрируют путем реадсорбции на ионообменных колонках, промывают водой и апюируют разбавленными растворами соляной кислоты. При этом пуриновые Дезоксирибомононуклеотиды быстро нейтрализуют водным раствором аммиака с целью избежания кислотного гидролиза, Дальнейи1ую концентрацию каждого полученного дезоксирибомононуклеотида в растворе осуществляют упариванием в вакууме раствора с последующим осаждением смесью этанола с эфиром или раствором сопей бария с аммиаком. Предлагаемый способ позволяет использовать в качестве исходного сырья отходы лроизводства протаминсульфата из молок рыб, которые до настоящего времени во всем мире не находят никакого применения и выбрасываются за ненадобностью. Получение дезоксирибомононуклеотидов из пред лагаемого сырья обходится в два раза дещеьле по сравнению с их получением из полимерных нуклеиновых кислот. 36 Ф 3 о б р ормула изооретения Способ получения дезоксирибомононуклеотидоБ путем экстракции исходного сырья, ферментативного гидролиза полученного экстракта с последующим выделением целевого продукта известными приемами, отличающийся тем, что, с целью расщирения сырьевой базы и повыщения выхода целевого продукта, в качестве исходного сырья используют отходы производства протаминсульфата из молок рыб, экстракцию осуществляют кислотой, а ферментативный гидролиз проводят нуклеазами из печени промысловых рыб.