Способ определения состава изолированных клеток на гистологическом препарате Советский патент 1980 года по МПК G01N33/00 

1

Изобретение относится.к цитологии и может быть использовано в цитохимии для количественной оценки содержания компонентов клетки.

Известен способ определения состава изолированных клеток на гистологическом препарате путем введения меченого предиественника ДНК окрашивания по Фельгену, нанесения фотоэмульсии, подсчета меченой ДНК и ее цитофотометрии 1.

Однако известный способ не позволяет точно определить состав изо.лиррванных клеток на одном препарате.

Цель изобретения - повышение точности способа за счет определения состава изолированных клеток на одHQM препарате.

iTa цель достигается тем, что до окрашивания по Фельгену ставят PAS,реакцию и определяют содержание гликогену, после чего препарат обрабатывают 0,020%-0,025% борогидридом натрия в течение от 20 до 30 мин при температуре от 2 до 5-с.

Способ осуществляют следующим Образом.

Вначале на предметном стекле приготавливают препарат-мазок изолированных клеток (например, для приготовления мазков изо Лированных клеток печени используют следующую методику: после декапитации животного печень- перфузируют в течение

5 10 минут смесью равных объемов фосфатного буфера (,0) и 5%-го раствора сахарозы, измельченные кусочки печени помещают на 8 мин в фосфатный буфер (,3) и затем

10 приготавливают-мазки от живoтнoгo, которому предварительно вводят меченый предшественник ДНК ЗН-тимидин (из расчета 1 микрокюри на грамм веса животного) и фиксируют его танолом. Затем на препарате выбирают неподвижные клетки на основе морфологических критериев и картируют препарат, т.е. замечают на нем положение каждой выбранной клетки

20 и нумеруют ее. После этого предметное стекло покрывают покровным, используя при этом в качестве заключающей среды глицерин, и измеряют сухой вес отмеченных клеток с по-

25 мощью интерференционнного микроскопа. Снимают по.кровное стекло, с помощью этанола удаляют глицерин, проводят флуоресцентную PAS-реакцию т.е. оксление клеток периодатом ка30 ЛИЯ (0,8%-ый раствор К10 на 0,3%-ой

азотной кислоте, ,2, температура комнатная, продолжительность окисления 90 мин) и окрашивание их затем реактивом типа Щ1ффа аурамиHOM-SO(2, (свежеприготовленный О , водный раствор аурамина О +0,2 мл хлористого тионила) в течение 90 ми при комнатной температуре (5-7), заключают препарат в вазелиновое масло и измеряют содержание гликогена в тех же клетках с помощью цитофлуориметра. Снимают покровное стекло, с помощью этанола или ксилола удаляют с препарата вазелиновое масло и обрабатывают его 0,025%-ным водным раствором борогидрида натрия в течение 30 мин при температуре 2-5с. Такая обработка приводит к полному удалению положительной PASреакции в клетках и блокированию альдегидных групп гликогена, образовавшихся ранее при окислении препарата периодатом содержание ДНК при этой обработке не затрагивается. Споласкивают препарат в 3-х сменах дистиллированной воды (по 1 мин. в каждой), вновь фиксируют его метанолом и высушивают на воздухе. Окрашивают препарат на ДНК с помощью обычной или флуоресцентной реакции Фёльгена, т.е. проводят гидролиз препарата в соляной кислоте (наприме 6NHC1 в течение 8-10 мин при комнатной температуре).окрашивают его соответственно обычным реактивом Шиффа или реактивом типа Шиффа аурамином - S02 (свежеприготовленный 0,3%-ый водный раствор аурамина 0+0,2 мл хлористого тионила,температуре 2,5с) в течение 90 мин, дифференцируют в сернистых водах и спиртах возрастающей крепости, высушивают на воздухе и заключают в вазелиновое масло. Содержание ДНК в отмеченных клетках, окрашенных с помощью обычной реакции Фёльгена, измеряют на абсорбцио 1ном цитофотометре, а окрашенных с помощью флуоресцентной реакции Фёльгена на . цитофлуориметре. Снимают покровное стекло, удаляют с препарата вазелиновое масло с помощью этанола или ксилола, обычным способом наносят фотоэмульсию на препарат, экспонируют его и затем определяют число зерен серебра над ядрами тех же клеток визуально или с помощью подходящей аппаратуры.

В результате проведения всех операций достигается точное определение в клетке каждого компонента. В качестве примера применения предлагаемого способа приводят результаты определения содержания гликогена и , сухого веса в синтезирующих и несентезирующих ДНК гепатоцитах крысы различной плоидности. Распределение клеток по содержанию ДНК следующее: диплоидные - 4,9%, тетраплоидные 85,8%, октаплоидные - 9,3%. Данные сведены в таблицу.

Ь.1,2,, Примечание: + Н-Т - клетки, включившие Н-тимидин

- клетки, не включившие Н-тимидин

Предлагаемый способ обеспечивает высокую точность за .счет определения соцтава изолированных клеток на одном препарате, он позволяет исследовать 3a.L.HOMepHOCTH соотношения содержания гликогена.. и сухого веса в популяциях «различных типов клеток, в частности в клетках к различной степени плоидности, клетках, находящихся на разных стадиях митотического цикла. Предлагае№лй способ мочсет быть использован не .только в ; теоретических работах, но и непосредственно в медицинской практике, где на диопсийном или хирургичаском материале можно исследовать соотношение содержания гликогена и сухого веса в клетках различной плоидности для диагностических целей. При этом содержание гликогена и сухой вес могут быть измерены даже в популяциях, которые содержат 1-5 % клеток с данной степенью плоидности.

Формула изобретения

Способ определения состава изолированных клеток на гистологическом препарате путем введения мученого предшественника ДНК, окрашивания по Фёльгену, йанесения фотоэмульсии, подсчета меченой ДНК и ее цитофотоматрии, отличающийс я тем, что,с целью повышения точности способа за счет определения состава изолированных клеток на одном препарате, до окрашивания по Фё льгену ставят PAS-реакцию и определяют содержание гликогена,после чего препарат обрабатывают 0,020%0,025% борогидридом натрия в течение от 20 до 30 минут при температуре от 2 до 5 С.

,V

- Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Папаян Г.В.,Агроскин Л.С., Бродский В.Я., Раутиан Л,П, Одновременное измерение количества вещества и интенсивности метки на окрашенных автографах.- Цитология, 1973,15,9, с, 1184-1190.