Способ диагностики хронического гепатита Советский патент 1984 года по МПК A61B10/00 G01N33/48 

Изобретение относится к медицин преимущественно диагностике заболеваний и непосредственно к диагности хронического гепатита. Известен способ диагностики гепа тита путем исследования .ткани печен заключающийся во взятии материала ткани печени с помощью пункционной биопсии, приготовлении и гистологической обработке препарата и устано лении заболевания по состоянию ткан печени L13 . Этот способ позволяет установить форму заболевания в целом и лишь гр бо оценить его степень только при сильно выраженном либо далеко зашедшем процессе. Проводить раннюю и точную диагностику заболевания, а также оценить степень его тяжести с достаточной чувствительностью этот способ также не позволяет. Это обусловлено тем, что первоначально поражение охватывает отдельные клет ки паренхимы печени и лишь позднее ткань и орган в целом, что выражается прежде всего в тонких изменениях структуры клеток и содержании в них различных компонентов. При слабо выраженных персистирующих фо мах хронического гепатита признаки заболевания также наиболее выражены лишь на клеточном уровне, что невозможно установить стандартной качественной гистологической методикой. Целью изобретения является повышение точности диагностики. Поставленная цель достигается те что согласно способу диагностики хр нического гепатита путем исследования ткани печени, ткань печени разделяют на изолированные клетки последовательной обработкой ее фосфат ными буферами с рН 7 ,,02 в течение 18-22 мин и с рН 0,02 в течение 13-15 мин, далее в изолированных клетках определяют содержа ние гликогена и при увеличении его в сравнении с нормой диагностируют хронический гепатит. Способ осуществляют следующим об разом. Ткань биопсийного материала последовательно обрабатьшают двумя фосфатными буферами: первым с рН 7,8+0,02 в течение 18-22 мин и вторым с рН 7,,02 в течение IBIS мин. Затем из кусочков, взятых из второго буфера, приготавливают 2 мазки живых изолированных клеток, которые фиксируют абсолютньм метанолом. На полученных препаратахмазках определяют относительное содержание гликогена в клетках с помощью известного цитофлуориметрического метода, включающего флуоресцентную РА-реакцию с последующей цитофлуориметрией гликогена; при этом флуоресцентную РА-реакцию с последующей цитофлуориметрией гликогена ставят на трех препаратах диагносцируемого материала и одном эталонном с известным содержанием гликогена. После зтого устанавливают абсолютное содержание гликогена в клетках диагносцируемого материала путем сравнения относительных результатов, полученных на диагносцируемых и эталонном препаратах.. При увеличении содержания гликогена в клетках диагносцируемого материала по сравнению с нормой диагностируют гепатит. При этом мазки живых изолированных клеток приготавливают путем перемещения капли взвеси;их на предметные стекла и разнесения каждой капли по предметному стеклу с помощью кварцевого стекла со шливованным краем. В качестве эталонного препарата используют неокрашенный препаратмазок фиксированных изолированных клеток печени с известным содержанием гликогена в граммах, который получен от лабораторного животного. После одновременной цитофлуориметрической обработки эталонного препарата с тремя диагносцируемы м в последних определяют содержание гликогена по формуле Дд, (КПЧ) ао 1лСКПК) V - содержание гликогена в клетках печени человека, г; ЛсрлСКЛЧ) - интенсивность флуоресценции клеток печени человека (усл.ед.), Зсу,,(КТ1К) - интенсивность флуоресценции клеток печени лабораторного животного, обработанных параллельно с клетками печени человека (усл. ед.); содержание гликогена в эталонном препарате клеток печени лабораторного животного, г.

Операцию по изоляции клеток из ткани печени путем последовательной обработки материала фосфатными буфсфами проводят только на живых клетках, что позволяет длительно сохранить их неповрежденными и получить точные данные цитофлуориметрического анализа.

Сравнение диагносцируемого материала с эталонным препаратом, в котором известно содержание гликогена в граммах, необходимо для получения результатов в абсолютных единицах .

Пример. Донор, 28 лет, поступил в больницу по поводу носительства Н (антиген вирусного гепатита) для обследования. При обследовании функциональные биохимические пробы оказались в пределах нормы.

Была проведена пункционная биопсия. Получено около 10 мг материала ткани печени. Половина этого материала была отправлена в клиническую лабораторию для приготовления и немедленной обработки препаратов гистологическими методами.

Другая половина была немедленно подвергнута количественному анализу на содержание гликогена в клетках с применением цитофлуориметрического метода, и полученные результаты абсолютного содержания гликогена были сопоставлены со стандартными показателями степени поражения печени согласно разработанному способ Для этого кусочек ткани печени помещали в стеклянный бюкс объемом 10 м с первым фосфатным буфером рН 7,8, где выдерживали в течение 18 мин. После этого глазными ножницами кусочки разрезали на несколько частей и помещали во второй фосфатный буфер с рН 7,2 в другом бюксе того же объема. По истечении 13 мин из кусочков приготавливали мазки живых изолированных клеток. Для этог малым глазным пинцетом извлекали каждый обработанный кусочек и выделяли из него живые изолированные клетки в каплю второго фосфатного буфера на поверхности предметного стекла путем осторожного потряхивания кусочка с помощью пинцета. Затем полученную взвесь живых изолированных клеток разносили по поверхности предметного стекла с помощью

тонкого кварцевого стекла с ровным шлифованным краем. Для этого осторожно прикладывали к капле взвеси шлифованный край кварцевого стекла и

быстрым, но плавным движением проводили им по всему стеклу. Фиксация мазка производилась немедленно путем нанесения капли абсолютного метанола пипеткой на предметное стекло

с мазком живых изолированных клеток печени. Фиксированный таким образом мазок высушивали на воздухе. Общая продолжительность указанных операций составила 40 мин. Было полу5 чено 10 препаратов-мазков изолированных клеток печени. На трех препаратах полученного диагносцируемого материала провели флуоресцентную РА-реакцию, Продолжительность реак- ,

0 ции при стандартных режимах 4 ч. Вместе с тремя препаратами диагносцируемого материала флуоресцентную РА-реакцию проводили еще и на эталонном одном препарате-мазке изолиро5 ванных клеток печенилабораторного животного с известным содержанием гликогена в граммах на 1 клетку печени.

Указанный эталонный препарат был взят невыборочно из серии

0 100 таких неокрашенных препаратов, которые предварительно были приготовлены следующим образом. Первоначально приготавливали препараты микрокапель 1%-ного раствора гликогена, микрокапли покрывали акриловым клеем, картировали и определяли в них количество гликогена в граммах с помощью интерференционного микроскопа марки МВИН-4. Затем приготавлиQ вали собственно эталонные препаратымазки, для чего производили перфузию печени нормальной крысы смесью 1/15 М фосфатного буфера с рН 8 и 5% сахарозы (1:1) в течение 10 мин.

д После этого из перфузированной печени крысы вырезали небольшие кусочки, которые помещали в другой 1/15 М фосфатный буфер с рН 7,3 и там вьщерживали в течение 8 мин. Из обработанных таким образом кусочков печени

крысы приготавливали 100 препаратовмазков изолированных клеток по указанной методике.

Содержание гликогена на эталонном препарате, а именно в клетках печени крысы, устанавливали путем одновременного цитофлуориметрического определения гликогена на,трех препара5тах микрокапель %-ного раствора г.п когена и на трех из 100 эталонных пр препаратах-мазках из расчета по фор муле ИГ. г, где у- среднее содержание гликогена на 1 клетку печени данного лабораторного животного (крысы); У - содержание гликогена в микро каплях гликогена, определенное иитерферометрически, г; Зо- интенсивность флуоресценции микрокапель гликогена с и.зве стным его содержанием окраск флуоресцентной РА-реакцией; Лц - средняя интенсивность флуоре ценции клеток печени данного лабораторного животного, обработанных флуоресцентной РА 5 -реакцией и измерен1гых с помощью цитофлуориметрии одновременно с препаратом микрокапель гликогена. Расчетами по этой формуле установлено, что среднее содержание гли когена на одну клетку печени крысы на эталонном препарате составило 243-10 г. После установления содержания гликогена на эталонных препаратах из оставшргхся 97 неокрашенных эталонных был выборочно взят один, который и использовали для сравнения U тремя препаратами диагносцируемого материала. Цитофлуориметрию гликогена на трех препаратах диагносцируемого материала и одновременно на одном эталонном после проведения на них флуоресцентной РА-реакции производили на опытном образце микрофлуори метра. Цитофлуориметрию препаратов производили в течение 3 ч, в резуль тате была оценена интенсивность флуоресценции 700 изолированных клеток печени больного и для сравнения 300 изолированных клеток печени на эталонном препарате. Резуль таты измерений обрабатывали статистически на ЭВМ. При обработке данны учитывались показатели эталона микрокапель гликогена и данные указанного биологического препарата-эт лона, что в целом позволило контрол ровать условия всех операций цитофл 26 ориметрического анализа. Каждый из 700 измеренных псэказателей лнтенсивности флуоресценции клеток больного сопоставляли со средним показателем каждого эталона-препарата. Среднее абсолютное содержание гликогена на 1 клетку печени больного было определено по формуле JcpA (КПЧ) а .10 г, of(mv.) где - содержание гликогена в клетках печени человека, г; 3(КПЧ) - интенсивность флуоресценции клеток печени человека, усл.ед.; Ocfx (КПК) - интенсивность флуоресценции клеток печени лабораторного животного, обработанных параллельно с клетками печени человека, усл.ед. Q - содержание гликогена в эталонном препарате клеток печени лабораторного животного,г. Этими расчетами установлено, что у больного содержание гликогена в клетках печени соответствует (203,1+ 6,9)10 г. Диагностика и определение степени тяжести хронического гепатита у больного проведены путем сопротивления этих показателей с установленными ранее стандартными показателями степени тяжести поражения печени на массовом статистически достоверном клиническом материале. Эти показатели представлены в таблицеВ результате было установлено, что повреждение клеток печени соответствует средней степени по вышеприведенным показателям, что отражает среднюю тяжесть хронического гепатита. Результаты исследования другого кусочка из того же биопсийного материала были получены через 7 сут после биопсии. Диагноз по этой методике (прототипу после сопоставления с результатами клйнико-биохимического анализа был следующий: у больного достоверных признаков вирусного гепатита не обнаружено, имеются признаки вирусного поражения части печеночных клеток. Указано, что исследование необходимо повторить. Через некоторое время больной вновь поступил в больницу с симптомами гепатита - ноющие боли в области печени, слабость, отсутствие аппе71тита и т.п. Биохимические показатели и протеинограмма близкие к норме (исключая легкое.повышение билирубина) . Окончательньй диагноз - хронический персистирующий вирусный гепатит . Таким образом, применение предлагаемогь способа в случае даже однократной биопсии позволило диагносцировать хронический гепатит у больного и определить среднюю степень тяжести его заболевания. При использовании комплексного клинического метода диагностики, включающего в себя ц способ-прототип, сходный диагноз бьш установлен на 17 дней позже.

Среднее содержание гликогена в изолированных клетках

печени человека, f- 10

Н2 28 Использование предлагаемого способа диагностики хронического гепатита позволяет по сравнению с известными повысить точность диагностики за счет оценки степени тяжести заболевания по объективным количественным показателям состояния специализированной функции печени на клеточном уровне; установить более раннюю диагностику за счет повышения чувствительности способа, а также за счет ускорения его технологии по сравнению с прототипом; повысить надежность диагностики благодаря возможности использования ЭВМ в клинической практике при обработке количественных диагностических показателей заболевания.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА путем исследования ткани печени, отличающийс я тем, что, с целью ранней диагностики, ткань печени разделяют на изолированные клетки последовательной обработкой ее фосфатными буферами с рН 7,,2 в течение 18-22 мин и с рН 7,,02 в течение 13-15 мин, далее в изолированных клетках определяют содержание гликогена и при увеличении его в сравнении с нормой диагностируют хронический гепатит.

Примечание. В скобках минимальные и максимальные значения.