Натриевая соль @ -4-нитрофенилацетил-трео- @ -3-нитрофенилсерина,обладающая иммунодепрессивным действием Советский патент 1983 года по МПК C07C233/51 A61K31/198 A61P37/06 

Изобретение относится к новому химическому соединению - натриевой соли М-4-нитрофенилацетилтрео-1)Ь-3-нитрофенилсерина, которая обладает иммунодепрессивным действием. Это свойство дает возможность предполагать его использование в медицине. Наиболее близким соединением по структуре является натриевая соль N-е6 -фенилацетил-И-м-салициден-трео -ВЬ-фенилсерина, обладаетцал противо воспалительным действием l . Однако указанное соединение не обГладает иммунодепрессивным действи ем. Целью изобретения является расши рение арсенала средств воздействия на живой организм. Известные иммунодепрессивные средства, как 6-меркаптопурин, азатиоприн, 5-фторурацил, недостатком которых является нежелательное побо ное действие 2j . Эта цель достигается новой химической структурой, описываемой формулой// C-C-COONa I / Н HNCOCH Соединение формулы 1 получают ацилированием трео-DL-3-нитросерина хлорангидридом 4-нитрофенилуксусной кислоты в водощелочной среде, и полученный N-4-нитрофенилацетил-трео-СЬ-З-нитрофенилсерин переводят в целевой продукт в метанольном растворе метилата натрия. Пример . К охлажденному льдом раствору 4,52 г 20,0 моль) Tpeo-DL-3-нитрофенилсерина в 50 мп 0,4 н. едкого натра (20,0 ммоль) в воде при энергичном перемешивании одновременно в течение 10 мин по каплям добавляют холодные растворы 4,0 г (20,0 ммоль) хлорангидрида 4-нитрофенилуксусной кислоты в 10 мл диоксана и 10 мл 2 н. водного едкого натра (.20,0 ммоль), следя за тем, что реакционная смесь в течение всего времени оставалась сла бощелочной. реакционную смесь перемешивают еще 1 ч при комнатной температуре/ охлаждают льдом, подкисляют 2 мл концентрированной соляной кислоты. Выделевшееся веществ отфильтровывают, на фильтре тщатель но прогнивают водой и перекристаплизовывают из смеси ацетона и воды (1: 1). Получат 5,3 г(б8%) N-4-нитрофенилацетилтрео-СЬ-З-нитрофенилсерина, т. пл. 204-205 ° С (разл.) Продукт представляет слегка желтоватые кристаллы, нерастворим в воде очень слабо в спирте, растворим в диметилсульфоксиде. ИК-спектр (в таблетках с KB на приборе Specord 71 IR): валентные колебания С 0 при 1645 см и NH при 3270 см в амид ной группировке, симм. валентные колебания N0 при 1345 . УФ-спектр (в этилового спирте на приборе Specord (JV -У35) 203 нм(е 27100 л.мол. , «акс 270 нм ( 15600 л.мол Г см). Найдено,%: С 52,44; Н 3,88; N 10,79. , Вычислено,%: С 52,45; Н 3,88;N 10;79. К раствору N-4-нитрофенилацетилTpeo-DL-3-нитрофенилсерина в эквивалентном количестве 0,5 н. метилата натрия в метаноле прибавляют эфир и выделяют натриевую соль N-4-нитрофенилацетилтрео-БЬ-З-нитрофенилсерина, которую хорошо промываэт эфиром и высушивают в вакуумэксикаторе (при плавлении разлагается). Т разл. 150-161° С. Продукт представляет аморфный порошок с сероватым отттенком, хорошо растворим в воде, метиловом и этиловом спиртах, ацетонитриле, ацетоне, этиловом ацетате, тетрагидрофуране, диметилформамиде, нерастворим в эфире, алифатических и ароматических углеводородах, хлороформе, растительных маслах. 1анные биологических испытаний показывают, что соединение обладает выраженным иммунодепрес сивным действием. Оно практически не токсично (его LDsoсоставляет 2500 мг/кг). Биологическую активность соединения 1 изучают по трем тестам, характеризующим функциональное состояние иммунной системы: 1)влияние на бласттрансформацию лимфоцитов; . 2)влияние на ингибицию к играцйи макрофагов; 3)влияние на образование гемаглютининов. Аллергизирующее действие препарата изучают при помощи кожноаллергической пробы с 2,4-динитрохлорбензолом. Эмбриотропное действие изучают опосредованно (через организм матеии) , воздействуя препаратом в период органогенеза зародыша. Исследование проводят на инбредных мышах линии СВА, морских свинках-альбиносах, крысах линии Wistar, в реакции бласттрансформации используют периферические лимфоциты периферической крови человека. Изу чение влияния натриевой соли N-4-нитpoфeнилaцeтил-тpeo-DL-3-нитрофенилсерина на бласттрансформацию лимфоцитов. Для постановки реакции бласттран формации лимфоцитов (РТБ) используют гепаринизированную кровь здоро вых доноров. Мононуклиарные клетки выделяют центрифугированием крови в фиколл-гипак градиенте, содержание лимфоцитов 40-60%. Количество жизнеспособных клеток, определяемых окраской трипановым синим, составляет 90% и выше во все сроки исследования. Клетки (1,5-10 мл) культивируют в среде 199 с добавлением антибиотиков СДОО ед/мл пенициллин и 100 ед/мл стрептомицина), 10% сы ротки человека АВ-группы и 10 мкг ФГА-Р (Дифко). В момент пос Тановки культуры до ФГА вносят испытуемый препарат в концентрациях: 5, 10, 20, 30 и 60 мкг/мл культуральной среды. За 4 ч до конца культивирования в каждую пробирку добавляют 1 мкк Н -тимидина (уд.ра диоактивность 17,6 Ci мМ). Через 72 ч начала культивирования каждую пробу переносит на миллипоровые фильтры, отмывают холодным 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты и физиологическим раствором. Радио активность подсчитывают на жидкост ном сцинтилляционном счетчике Марк 11. Результаты выражают в процентах метки по отношению к контрольным стимулированным культу рам, принятым за 100%. Результаты опыта приведены в .табл. 1. Из табл. 1 видно, что испытуемы препарат в малых концентрациях 5 10 мкг/мл практически не изменяет включение меченого предшественника ДНК по сравнению с контролем. В концентрациях 20, 30 и 60 мкг/мл препарат оказывает ингибирующее действие, наиболее выраженное в ко центрации 60 мкг/мл (36% по отноше нию к контролю). Следует отметить, что в испытанных концентрациях пре парат не оказывает цитотоксическог эффекта. Включение меченого предшественника в культуры лимфоцитов, не стимулированных ФГА, после внесения препарата такое же, как и в контрольных культурах без ФГА. Изучение влияния натриевой соли и 4-нитрофенилацетилтрео-01-3-нитр фенилсерина на ингибицию миграции макрофагов. Метод ингибиции миграции макрофагов позволяет определить функцио нальную активность Т-клеток эффекторов . Морским свинкам-альбиносам, весом 250-300 г, вводят подкожно по 2 мг БЦЖ. Перитоксальные макрофаги от этих животных берут на 21-ый день, после сенсибилизации БЦЖ. Испытуемый препарат вводят сенсибилизированным БЦЖ морским свинкам в дозах 50 и 75 мг/кг, пятикратно, начиная со дня сенсибилизации. За двое суток до постановки реакции опытным и контрольным морским свинкам вводят внутрибрюшинно 10 мл стерильного 2%-ного пептона. Из экссудата брюшной полости этих животных получают клетки. Клеточная суспензия перитониального экссудата содержит 25% полиморфноядерных лейкоцитов, 10% лимфоцитов и 65% макрофагов. Отмытые и ресуспендированные в среде 199 клетки набирают в тонкие стеклянные капилляры (диаметр 1 1,5 мм) и центрифугируют при 800 1000 об/мин с тем, чтобы получить рыхлый осадок клеток. Капилляры одинаковой длины (1-1,2 см) с клетками помещают в специальные стеклянные камеры и прикрепляют разогретым парафином. Камеры заполняют питательной средой 199, содержащей 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина и 10% инактивированной нормальной сыворотки морской свинки. В питательную среду для опытных образцов добавляют антигентуберкулин в дозе 25 мкг/мл, в соотношении 0,8 МП среды 199 и О,2 мл антигена. Края камер смазывают стерильным вазелином и сверху закрывают стеклом. Опытные и контрольные камеры инкубируют при 37 °С.в течение 24 ч, после чего камеры помещают под микроскоп и с помощью рисовального аппарата (РА-4), .укрепленного на тубусе микроскопа, производят зарисовку зон миграции на бумаге, после чего их вырезают, взвешивают На торзионных весах и вычисляют процент ингибиции миграции макрофагов по формуле: площадь миграции с антигеном плсмдадь миграции без антигена Результаты опытов приведены в табл. 2. Из табл. 2 видно, что испытуемый препарат ингибирует миграцию.- маркофагов Б1Щ - сенсибилизированных морских свинс. в присутствии антигена. Ингибирующее действие препарата наибо.лее выражено в дозе 75 мг/кг (почти на 50% по сравнению с контролем, принятым за 100%). Изучение влияния натриевой соли И-4-нитрофенилацетилтрео-БЬ-3-нитрофенилсерина на гуморальный иммунитет. Эксперименты проводят на инбред ных гюлшах линии СНА, используя метод определения титров гемагглютининов к бараньим эритроцитам. Препарат в дозах 50 и 75 мг/кг вводят опытным животным внутрибрюшинно в течение трех дней, начиная со дня иммунизации эритроцитами барана. ЭритроцИны вводят внутрибрюшинно, однократно, по 0,3 мп 50% взвеси в физиологическом растворе. Спустя 5 дней определяют титры гемагглюти нинов по общепринятой методике. Бы ло обнаружено, что натриевая соль N-4-нитрофенил ацетил трео-15Ь-3-нитр фенилсерина в дозах и 75 мг/кг, не влияет на титры гемагглютинов, которые остаются на урйвне контроля (1 : 88),, Изучение влияния натриевой соли Н -4-нитрофенилацетилтрео-1)и-3-нитрофенилсер1 на на аллергизирующее действие в кожно- ллергической пробе с 2,4-динитрохлорбензолом (2,4 ДНХБ). Для определения аллергизирующей активности испытуемый препарат вводят опытным животным, затем индуцируют с помощью накожной аппликации 2,4 ДНХБ аллергический контактный дерматит и определяют влияние препарата на развитие кожной реакции к 2,4 ДНХБ, Если препа рат обладает аллергизирующим дейст вием, то реакция кожи на 2,4 ДНХБ усиливается, В опытах использованы морские свинки-альбиносы, самцы, весом 250-300 г. На тщательно выстриженные участ ки кожи правой и левой лопаток, размером 2-2 см, при помощи глазно пипетки наносят по 2 капли 50%-ног раствора 2,4 ДНХВ, каждую каплю вт рают в кожу стеклянной палочкой сенсибилизирующая доза. 2,4 ДНХБ разводят смесью спирт-ацетон в соотношении 1:2. Через 24-48 ч у морских свинок развивается аллерги ческий контактный дермат-ит. На . 14-й день после сенсибилизации животным выстригают на спине два участка размером см каждый, и наносят по 1 капле 2,4 ДНХБ в следующих концентрациях: 1/250, 1/500 1/1000, 1/2500 - разрешающая доза. В случае, если испытуемый препарат сенсибилизирует организм, то реак ция на 2,4 ДНХБ наблюдается в высоких разведениях (1 : 1000, 1 :25qO Натриевую соль N-4-нитрофенилацетилтрео-1)Ь-3-нитрофенилсерина вводят морским свинкам подкожно за месяц до нанесения, сенсибилизирукяце дозы с 2,4 ДНХБ и продолжают вво-. дить препарат животным и в период развивавшегося аллергического контактного дерматита, в течение двух недель. Препарат испытан в следующих дозах: 10, 25, 50, 75 и 100 мг/кг, В каждой группе было по 10 животных. Контрольным, свинкам наносят накожно 2,4 ДНХБ, испытуемый препарат им не вводят. Интенсивность сенсибилизации оценивают визуально по выраженности воспалительной реакции кожи на месте кожной пробы по пятибальной системе : 0- отсутствие видимой реакции, 1- слабая эритема, 2- четкая эритема, 3- то же, с уплотнением, 4- резкая эритема с явлениями геморрагии, выраженный инфильтрат , 5- серозно-геморрагическая корка с изъязвлениями. В результате проведенных экспериментов выявлено, что испытанный препарат в дозах 10, 25, 50, 75 и 100 мг/кг не влияет на течение аллергического контактного дерматита, индуцированного накожной аппликацией 2,4 ДНХБ. Интенсивность реакции у опытных животных существенно не отличается от контроля (0-1 балл). Следовательно, испытуемый препарат не влияет на развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа.. Изучение эмбриотропного действия натриевой соли н-4-нитрофенилацетилтрео-1)и-3-нитрофенилсерина. Опыты проводят на крысах линии Wistar, Животным вводят внутримышечно испытуемый препарат с 8-го по 15-ый день беременности, что по времени совпадает с периодом органогенеза и плацентации, в следующих дозах: 75 и 100 мг/кг. Для выявления влияния препарата на -плод животных забивают на 21-ый день-беременности На вскрытии осматривают.рога матки, яичники, плоды и плаценты. Учитывают количество желтых тел в яичниках, число мест имплантации, наличие в матке живых, мертвых и резервированных плодов. На основании этих данных вычисляют предимплантационную и общую эмбриональную гиб.ель плодов. Все плоды и плаценты взвешивают и рассматривали под микроскопом МБС-1, при этом отмечают наличие у них внешних изменений и отклонений в развитии. Результаты опытов представлены в табл. 3, В результате проведенных опытов установлено, что введение животным натриевой соли N-4-нитрофенилацетил Tpeo-DL-3-нитрофенилсерина в дозах 100 и 75 мг/кг не вызывает увеличение общей и постимплантационной гибели плодов ( Р - 0,05). Из этих данных можно сделать вывод о том, что натриевая соль N-4-нитрофенилацетилTpeo-DL, -3-нитрофенилсерина обладает иммунодепрессивным действием, выявленным на моделях клеточного иммунитета (снижает включение меченого предшественника ДНК в культурах лимфоцитов и ингибирует миграцию макрофагов), но не влияет на гуморальный иммунитет (титры гемагглютининов у опытных животных на уровне контроля} Препарат не токсичен U -bso 2,5 г/кг. Влияние натриевой соли Н-4на ФГА-индуцированную

Таблица нитрофенилацетИлтрео-г.-3-нитрофенилсерина бласттрансформацию лимфоцитов 2 При испытании новых иммунотроп- ных препаратов чрезвычайно важным является изучение аллергизирукжцего и иммунотропного действия испытуемого препарата. Выявлено, что натриевая соль N-4-нитрофенилацетилтрео-DL-3-нитрофенилсерина ингибирует реакции клеточного иммунитета, для изучения алергизирунхчего действия этого препарата выбрана модель аллергического контактного дерматита, которая отражает состояние Т-лимфоцитов и относится к реакциям гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Установлено, что соединение формулы 1 аллергизирующим и эмбриотоксическим действием не обладает.

Натриевая соль н-4-нитрофенилацетилтрео-01-3-нитрофенилсерина формулы ОН Н I f ci - I H HN-e 0 ймг 2 02N обладакицая-иммунодепрессивным действием.

Примечание.- Во всех опытах стандартные ошибки ниже 5-10%.

Влияние введения натриевой соли Н-4-нитрофенилацетилтрео-Т)и-3-нитрофенилсерина на ингибицию миграции маркофагов

Препарат не

вводят

(контроль)

Таблица2

100 Изучение эмбриотропного действия Tpeo-DL1/4 + 0,6

3,4 + 1,4 1,6 + 0,7 2,7 + 1,2 1,5 + 0,7 3,0 + 1,4 3,6 + 0,04 0,61+0,01 3,5 + 0,005 0,59+0,003 3,95 + 0,03 0,63 + 0,01 Таблица 3 натриевой соли N-4- итрофенилацётил3-нитрофенилсерина