Средство,обладающее иммунодепрессивным действием Советский патент 1982 года по МПК A61K31/513 A61P37/06 

(54) СРЕДСТВО, ОБЛАДАКЩЕЕ ИММУНОДЕПРЕССИВНЫМ ДEЙCfBИEM

1

Изобретение относится к фармакологии и может быть использовано для биологических исследований.

Известно химическое соединение 2,4,6-триметил-5-оксипиримидик.

Цель изобретения - расширение арсенала иммунодепрессивных средств.

Эта цель достигается применением 2,4,6-тpимeтил-5-oкcипиpи идинa в качестве средства, обладающего иммунодепрессивным действием. Бьши проведены исследования на мышах и морских свинках. При парентеральном введении средства обоим видам животных в дозах от 50 до 2000 мг/кг веса гибель их отмечалась лишь начиная с дозы 1000 мг/кг.

Иммунобиологические свойства средства изучены на модели одновременного определения лимфотоксического и митостатического действия в реакции гиперчувствительности замедленного типа и реакции бласттрансформации, кроме того, изучено влия-

ние средства на количество клеток, .ответственных за выработку антител и титры гемагглютининов при первичном и вторичном ответе.

V

П р и м е р 1. Исследования митостатического и лим|)отоксического действия ОПИ-Ш.

Избирательное митостатическое и лимфотоксическое действие сред10ства изучено на зкспериментальной модели для одновременного их определения, основанной на реакции трансплантат - против хозяина и оценено по количеству колониеобразуккцих клеток (КОЕ) в селезенке мышей после однократного внутрибрюшинного введения препарата в дозах 50, 100, 250 и 500 мг/кг веса. Препарат разводят раствором Хенкса при нагревании до , рН раствора доводят до 7,2-7,41.

Митостатический и лимфотоксический эффект средства показан в табл.1.

25(18-36)

40 22(13-24)

40

Из таблицы видно, что введение препарата в дозах от 50 до500мг/кг не оказывает митостатического действия, т.е. не влияет на размножение эндогенных стволовых клеток. Избирательное лимфотоксическое дейстане средства, приводящее к отмене кванинактивации стволовых клеток, отмечается .во всех исследованных дозах. При 50 мг/кг количество выживших КОЕ составляет 27%. Наибольший лимфотоксический эффект наблюдается при 250 мг/кг (46% КОЕ). Дальнейшее увеличение дозы .;до 500 мг/кг не приводит к увеличению КОЕ в селезенке. X контрольных животных количество КОЕ около 10%. Полученные результаты показывают, что средство в исследуемых дозах обладает выраженньм лимфотоксическим действием. Митостатический эффект препарата не наблюдается, что указывает на отсутствие угнетающего действия на костный мозг.

П р и м е р 2. Влияние средства на реакцию гиперчувствительности заимедленного типа.

Морских свинок (4 группы по 5 в каждой) сенсибилизируют динитрохпорбензолом ДИХБ нанесением и выбиранием в выстриженные участки кожи спи№1 по 1 капле 5% и 50% расвора. Средство вводят в подушвчки лап в дозе 250 мг/кг по следующим схемам: I группа - одновременно с

Таблица 1

12(7-28) 40

46

11(7-17)

42

40

сенсибилизацией и в последующие 2 дня однократно; 2 группа - за день, в день и через день сенсибилизации , 3 группа - за два дня, за день и в день перед разрешающей дозой ДНХБ; 4 группа - контрольные сенсибилизированные животные, не получающие препарат.

Спу-стя 21 день наносят разрешагацую дозу ДНХБ (1:2500, 1:1000,1:500, 1:250) и через 18-24 ч оценивают реакцию гиперчувствительности замедленного типа РГЗТ по кожным реакциям (гиперемии, инфильтрации, болезненности, шелушению кожи).

При нанесении сенсибилизирующей

® дозы ДНХБ в контрольной группе животных отмечалось резко положительная кожная реакция с болезненностью, отечностью, гиперемией, инфильтратами. В последуницие дни появляется

шелушение эпидермиса и струп в местах нанесения ДНХБ. При вьщеяении средства кожные реакции отличаются более слабой интенсивностью (или отсутствием реакций) и спектром про50 явления (отсутствие болезненности, быстрее исчезала гиперемия, инфиль- были меньших размеров). Разрешающие дозы ДНХБ через 24 ч вызывают у животных контрольной груп55 пы отечность, болезненность, ги паремию при всех разведениях. У жи-. вотнык получавших средство до сенсибилизации (2,группа), а также до разрешающих доз ДНХБ (З группа) , только в разведении 1:250, 1:500 отмечалась слабая гиперемия. При введении средства одновременно или .после сенсибилизации ,( J группа ре акция на разрешающие дозы ДНХБ более выражена и наблкщается даже в разведении 1:1000 и 1:2500. Полученные данные показывают, что средство тормозит развитие РГЗТ причем более выражено при введении препарата до сенсибилизации. При м ер 3. Влияние ОПМ-111 н количество антителосинтезирующих клеток (С АОК) и титры гемагглютинино на пике первичного и вторичного отв та изучено у мышей линии ОБА, иммунизированных внутрибркяпинно эритроцитами барана. Препара вводят однократно в дозе 50, 100,

После однократного внутрибрюшиниого введения препарата за дань до первичной иммунизации мышей незначительно снижается количество АОК в селезенке даже в дозах 250 и 500 мг/кг.

Введение препарата в день иммунизации и последующие 3 дня в дозе 250 мг/кг также оказывает слабый эффект на количество АОК при первичнЬм ответе. Более выраженное действие препарата на количество АОК

отмечается при вторичном ответе. Так уже при однократном парентеральном введении препарата в дозах 250 и 500 мг/кг за день до повторной иммунизации число АОК уменьшается на порядок по сравнению с контролем. Эффект препарата при вторичном ответе также выражен при многократном введении.

Титры гемагглютининов с сыворотке крови животных при первичном и вторичном ответе оценены на 4 день 250 и 500 мг/кг веса за день иммунизации, а также в дозе 250 мг/кг ,по следукщим схемам: 1 - в день, через день, через 2 дня и через 3 дня после первичной иммунизации и И за 3 дня, за 2 AIIH за день и в день перед второй иммунизацией, проведенной через 14 дней после первичной. Количество АОК в селезенке мьр шей определяют модифицированным методом локального гемолиза на 3-й и 4-й дни после иммунизации. Количество зон гемолиза рассчитывают на 10б ядросодержащих клеток. Уровень антител оценивают в реакции гемагглютинации. Б табл. 2 локазано количество АОК в селезенке мьш1ей при первичном и вторичном ответе после однократного введения ОПМ-111. аблица2 ;

после иммунизации. Средство вводят однократно в дозе 250 мг/кг за 24 ч до иммунизации.

При первичном ответе введение препарата практически не снижало количество антител ( титр в контроле 1:320, в опытной группе 1:160l 320),, при вторичном ответе влияПервичньй ответ за день до иммуш зации

За 3,2, и 1 дни до иммунизации и в день иммунизации

Вторичный ответ за день до имму низ ации

За 3,2 и I дни до иммунизации и в день иммунизацииПроведенные исследования показывают, что новое средство обладает ингибирующим действием на клеточно- опосредованные иммунные реакции без супрессии образования антител. Средство обладает лимфотокси еским эффектом во всех исследованных дозах (от 50 до 500 мг/кг), наибольший зффект отмечается в дозе 250 мг (46% выживпшх КОЕ). При сравнении с известными иммунодепрессантами аналогичное действие отмечено у гид рокортизона при введе1ф и 10 мг/кг (44% выживших КОЕ). При введении животным 25 мг/кг гидрокортизона и выше быстро нарастает цитотоксичность препарата. Введение 5 мг/кг резко снижает избирательно лимфотоксическое действие, т.е. гид рокортизон обладает малой у широтой специфического лимфотоксического действия.

ние препарата на гуморальный ответ не отмечается, тирть: гемагглютинннов такие же, как в контрольной груггпе.

Влияние на количество АОК в селезенке мьппей в зависимости от схемы введе1шя показано в табл. 3.

ТаблицаЗ

288+35,2 202+28,0

280+41,8

1080+153,0 920+113,2

480+61,4

20 Предлагаемое средство малотоксично ( не обладает митостатическим действием в дозах от 50 до 500 мг/кг не влияет на клетки костного мозга) и при этом обладает относительно высокой широтной избирательного лимфотоксического действия. Это является преимуществом перед используемыми в клинике иммунодепрессантами в том числе и глюкокортикоидами. Препарат тормозит развитие РГЗТ при сенсибилизации морских сви- ; нок ДНХБ. Предлагаемое средство обладает преимущественным действием на кле- точно-опосредованные реакции бласттрансформации, РБГ, РНЗТ, Слимфотоксический зффект), зависящие не столько от дозы препарата, сколько от схемы введения. Наибольшее ингибирующее действие препарат оказывает при многократном введе1ши, 1гачатом до антигенного стимула ( иммунизации введения митогенов, сенсибилизации) Снижение количества антителопродуци рующих клеток отмечается главным образом при вторичном ответа. Титры антител при разных схемах введения препарата не снижаются по сравнению с контрольной группой. С увеличением дозы (до 500 мг/кг) иммунодепрессивный эффект не возрастает, а даже снижается. В исследованных дозах препарат не обладает цитотоксическим действием. Антипролиферативный эффект in v(tro также выражен относительно слабо ( концентра ции препарата 100 и 250 мкг/мл ингибируют включение Н -тимидина в ДНК на 7 и 18% соответственно, а 500 мкг/мл на 35%, т.е. средство ок зывает слабое влияние на популяцию Т-клеток-супрессоров В то же время малые дозы препарата (50 мкг/мл) обладают стимулирук г чм действием. Полученные данные r.i/и сравнительном изучении антипролиферативной активности глюкокортикоидов показали, что они значительно ингибируют синтез ДНК в лимфоцитах периферической крови человека в зависимости от дозы. 6 Так гидрокортизон и презнизолон в концентрации 0,5 мкг/мл включение Н-тимидина в ДНК на 40-50% по отношению к контролю, принятому за 100% урбазон на 60-70% в концентрации 10 мкг/мл - на 50, 70 и 90% соответственно. Все препараты в концентрации 50 мкг/мл практически подавляют синтез ДНК, проявляя цитотоксический эффект. Средство обладает малой токсичностью, оказывает избирательное действие на клеточно-опосредованные иммунные реакции без подавления гуморального иммунитета и костномозгового Кроветворения. Применение 2,4,6-триметил-5-оксипиримидина в качестве иммунодепрессивного средства может быть использовано в медицине при аутоимунных заболеваниях и при трансплантации органов и тканей. Формула изобретеьшя Применение 2,4,6-гриметил-5-оксипиримидина в качестве средства, обладающего иммунодепрессивным дейтвием.