Способ получения конъюгированных антигенов барбитуровая кислота-иммуногенный носитель Советский патент 1982 года по МПК C07D239/62 

ный хлорформиат вводят в реакцию с иммуногенным носителем в молярном соотношении 30-100: 1. В качестве иммуногенного носителя используют сывороточные альбумины, иредночтительно бычий сывороточный альбумин. Реакцию ироводят в водно-диоксановом растворе при О-10° С и рН 8-9 в течение 24 ч, причем рН раствора поддерживают добавлением 10%-ного раствора гидроокиси натрня. Полученный конъюгированный антиген отделяют от низкомолекулярных примесей диализом против дистиллированной воды и лиофильно высушивают. Количество остатков барбитуровой кнслоты, ковалентно связанных с молекулой белкового носителя, устанавливают спектрофотометрически по разнице содержания свободных аминогрупп в исходном белке и полученном конъюгированном антигене, применяя в качестве реагента на аминогруппы тринитробензолсульфокислоту. В зависимости от молярного сооткоше,кия вводимых в реакцию хлорформиата и белка получают конъюгированиые антигены, содержащие различные количества остатков барбитуровой кислоты, ковалентно связанных с молекулой белка. Так, если молярное отношение хлорформиата барбитуровой кислоты к белку составляет 30-100 : 1, то получают конъюгированные антигены бар-битуровая кислота-иммуногенный носитель, содержащие 3-17 остатков барбитуровой кислоты, ковалентно связанных с 1 моль белка, соответственно (см. табл. 1). В известном способе получают конъюгированный антиген, содержаш;ий 2-3 остатка барбитуровой кислоты, связанные с молекулой носителя при использовании молярного отношения производной барбитуровой кислоты к носителю 500-1000:1. Конверсия реакционно-способного производного барбитуровой кислоты в предлагаемом способе составляет 5-16%, в то время как в известном способе 0,1-0,3%. Пример 1. а) Способ получения 5-(1-метилбутил)-5-(2 - оксипропил) -барбитуровой кислоты. В 20 мл концентрированной серной кислоты растворяют- и 2 г (0,09 моль) 5-(1метилбутил)-5 - аллилбарбитуровой кислоты. Раствор выдерживают при комнатной температуре 20 мин, выливают в ледяную воду. Образующийся осадок отделяют, высушивают и перекристаллизовывают из водного этилового спирта. Получают 1,3 г 5-(1-метилбутил) - 5-(2-оксипропил) - барбитуровой кислоты. Выход 60%. Т. пл. 205° С. -Литературные данные: т. пл. 205- 206° С. б) Способ получения конъюгированного антигена 5-(1-метилбутил)-5-пропилбарбитуровой кислоты с бычьим сывороточным альбумином. К раствору 4 г (0,015 моль) 5-(1-метилбутил) - 5-(2-оксипропил) - барбитуровой кислоты в 60 мл тетрагидрофурана добавляют раствор 3 г (0,030 моль) фосгена в 10 мл тетрагидрофурана и 12 мл пиридина. Реакционную смесь перемешивают в течение суток при комнатной температуре. Выпавший осадок хлоргидрата пиридина отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток экстрагируют многократно эфиром. Эфирный раствор промывают водой, сушат над хлористым кальцием, уп-аривают и получают 4,6 г хлорформиата 5-(1-метилбутил) - 5-(2-оксипропил)-барбитуровой кислоты. Выход 85%. Полученный хлорформиат без дальнейшей очистки вводят в реакцию с бычьим сывороточным альбумином. Для этого 10 г белка (0,000145 моль) растворяют в 150 мл воды, доводят рН раствора до 8-9 10%-ным раствором гидроокиси натрия. К полученному раствору при О-10° С при перемешивании по каплям добавляют раствор (0,0145 моль) хлорформиата в 100 мл диоксана, поддерживая рН 8-9 добавлением 10%-ного раствора гидроокиси натрия. Реакционную массу перемешивают 4 ч и оставляют на ночь при О-4° С. Полученнъш конъюгированный антиген очишают от низкомолекулярных примесей диализом против дистиллированной воды в течение 7 дней. Раствор лиофильно высушивают. Получают 10 г коиъюгироваиного актигена. Спектрофометрически устанавливают, что в нем с 1 моль белка ковалентно связаны 17 моль соответствующей барбитуровой кислоты. Пример 2. По вышеописанной методике из 1,6 г (0,005 моль) 5-(1-метилбутил)-5-(2-оксипропил) - барбитуровой кислоты и .10 г (0,000145 моль) белка получают коИъюгированнЪ1й антиген 5-(1-метилбутил)-5-пропил - барбитуровой кислоты с бычьим сывороточнъш альбумином, содержащим 2-3 моль барбитуровой кислоты, связанной с 1 моль белка. Пример 3. По вышеописаиной методике из 4 г (0,012 моль) 5-(1-метилбутил)5-(2-хлорформиатопропил) - барбитуровой кислоты и 10 |Г (0,000145 моль) белка получают конъюгированный антиген 5-(1-метилбутил) -5-пропилбарбитуровой кислоты с бычьим сывороточным альбумином, содержащий 10 остатков барбитуровой кислоты, ковалентно связанных с 1 моль белка. ,1

Данные примеров приведены в табл. 1.

т а б л и ц а 1

Пример 4. Антигенные свойства полу|Ченных конъюгатов.

Крыс и кроликов иммунизируют внутримышечным введением конъюгированно-то антигена барбитуровая кислота-белок,

Содержание барбитуров котором с 1 моль белка ковалентно связаны 3 моль барбитуровой кислоты, в дозе 25 мг/кг 2 раза в неделю в течение 2-х месяцев. Через две недели после последней иммунизации препар.атом у животных берут кровь и выделяют сыворотку крови. Иммунизацию кроликов и крыс конъюгированными антигенами, в которых с молекулой белка-носителя ковалентно связаны 10 и 17 моль барбитуровой кислоты, осуществляют аналогично. Антигенность всех полученных соединений, определяют по количеству антител, индуцируемых конъюгатами, реакцией пассивной гемаглютинации на танизированных эритроцитах по известному методу. Полученные значения титров антител приведены в табл. 2.

Таблица 2

Тнтры антител

Формула изобретения Способ получения конъюгированных антигенов барбитуровая кислота-иммунюгенный носитель, отличающийся тем, что 5-алкил-5 - хлорформиатоалкилбарбитуровую кислоту подвергают взаимодействию с иммуногенным носителем при мо.лярном соотношении 5-алкил-5-хлорформиатбарбитуровая кислота : носитель равном 30-100 : 1 при рН 8-9 и температуре О-10° С. Источник информации, принятый во внимание при экспертизе: 1. Патент США № 3766162, кл. 260-112, опубл. 1973.