Способ получения конъюгированных производных барбитуровой кислоты для иммунохимического анализа барбамила Советский патент 1993 года по МПК C07D239/62 

Изобретение относится к способу получения новых коньюгированных производных барбитуровой кислоты, обладающих свойствами реагентов для иммунохимиче- ского анализа барбамила, которые могут найти применение в иммунохимическом анализе.

Целью изобретения является получение конъюгированных производных барбитуровой кислоты с иммунотенным носителем, обладающих более высокой чувствительностью и позволяющих снизить процент перекрестных реакций при иммунохимическом анализе барбамила.

Указанная цель достигается способом получения конъюгатов бычьего сывороточ ного альбумина (БСА) с 5-изозмил-5-{5 -кар- боксипентил)-барбитуровой кислотой, предварительно модифицированной изобу- тилхлорформиатом.

Способ осуществляют следующим образом: к раствору 5-изоамил-5-(5 -карбокси- пентил)бэрбитуровой кислоты в диоксане. добавляют триэтиламин, для связывания выделяющейся при реакции соляной кислоты, и при охлаждении добавляют изобутилхлорформиат. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 3 мин при 0-10РС и добавляют к раствору БСА в 0,01 М карбонатном буфере (рН 8-9). в мольном соотношении 50:1-100:1, выдерживают при 0-10°С в течение 24 ч. Полученный продукт очищают диализом в проточной воде в течение 2 дней и затем лиофилизуют,

Количество остатков барбитуровой кислоты, ковалентно связанных с молекулой БСА, устанавливают спектрофотометриче- ски по разнице содержания свободных аминогрупп в исходном белке и полученном конъюгированном антигене, применяя в ка00

со ю

го

ю

честсе реагеша на аминогруппы тринитро- бензолсульфокислоту.

. Нижеследующие примеры иллюстрируют синтез конъюгированных производных баг литч оовой кислоту и их использования для анализа барбзмила.

р и м е р -1. Получение конъюгата бычьего сывороточного альбумина с 5-изо- 8мил-5-(5 -кзрбоксипент11л)барбитуровой кислотой (при соотношении 1:50).

К раствору 31 мг (100 мкмоль) 5-изо- амил-5-(51- сарбоксипе.нтил)барбитуровой кислоты в 1 мл диоксана добавляют 50 мкл тризтилзминз, охлаждают до 0-10°С и добавляют 20 мкл изобутилхлорформ латв. Ре- а к ц и о н н у ю с м е с ь п е р е м е ш и в а го т п р и 0-10°С в течение 2-3 мин. Затем смесь добавляют к раствору 140 MI {2 мкмоль) БСА а 5 мл 0,01 М карбонатного буфера (рН В), содержащему 5 мл диоксанз. Реакцию ведут 24 ч при 0-10°С.. Синтезированный конъю- гат выделяют диализом в проточной воде в течение 2 дней м затем лиофилизируют. В полученном продукте с одной молекулой БСА ковалентно связано 14-16 молекул 5- мзоамил-5-(5 -карбоксипентил)барбитурр- вой кислоты,

П р и м е р 2. Получений кснъюгата бычьего сывороточного альбумина с 5-изо- амил-5-(5 -карбо сипеитил)барбитуровйй кислотой {при соотношении 1:100).

Содержание 5-изоамил-5-(5-кур6о сипентк

барбитуровой кислоты в коныогате, мол.

14-16

18-20

Полученный коиъюгироианный антиген индуцирует у животных высокоспецифичные антитела к бзрбамилу. Перекрестные реакции с другими структурно-подобными соединениями не превышают 8%.

Пример 4. Определение бароаммла с помощью реагентов на сс:;сие 5-изоамил-5- (5 -кзрбоксилентил)бзрбитуропой кислоты,

В пластмассовые контейнеры, помещенные в измерительную карусель с кюветами, вносят по 50 мкл модельных образцов мочи, содержащих различные концентрации бэрбамила. Разбавленная в 40 раз кроличья антисыворотка против.барбамила, раствор j3 аммнофлуоресцеинтиокзрбами- лэтмламида 5-изоамил-5-(5 -карбоксилен- тиг()барбитуроаой кислоты в концентрации 130 нмоль/л и фосфатный буфер (рН.7,6), содержащий 1 г бычьеготамма-глобулина и 1 г эзида натрия, наливают в три отдельных флакона, установленных в одной специальной коробке: Коробку с реагентами и.кару

По описанной методике из 31 мг (100 м к м о л ь) 5-и зо а м и л -5-(5 - к а р бо к с и п е н- тил)барбитурооой кислоты и 70 мг(Т мкмоль) БСА при рН 9 и температуре 0-10°С получают конъюгированный антиген, в котором, с одной молекулой БСА ковалентно связано 18-20 молекул 5-изоамил-5-(5 -карбоЈси- пентил)барбитуровой кислоты.П р м м е р 3. Антигенные свойства

полученных кот ьогатов.

Кроликов иммунизируют подкожно, введением коныогированного антигена, в котором с оной молекулой БСА ковалентно связано 14-16 остатков барбитуровой кислоты. Иммунизацию проводят 50%-ной эмульсией водного раствора коныогата и полного а/тыованта Фрейнда в дозе 2 мг/кг, в течение 3 недель с интервалом 7 суток. Реимг-.тунизацию осуществляют через месяц,

в течение 3 дней, ежедневно еводя конъюгат в дозе 5 мг/кг внутривенно. Через неделю отбирают кровь и выделяют сыворотку. Иммунизацию, кролико.в конъюгированным.антигеном, о котором с молекулой БСА связано1

18-20 ОСТЭТКОЕ барбитуровой кислоты, осуществляют аналогично. Антигенность всех полученных соединений определяют по количеству антител, индуцируемых коньюгатом, с помощью прямого поляризационного флуороиммумояиализа. Полученные значения тиров антисывороток представлены ниже.

Титр антисыворотки

о

1:1200-1:1800 1:2400- 1:3200

сель устанавливают в прибор (ТДХ-анализатор фирмы Abbott), который автоматически выполняет анализ по заданной программе. Концентрацию барбамила в образце мочи прибор автоматически определяет по величине поляризации флуоресценции на построенном заранее и хранимом в памяти прибора калибровочном графике; концентрация бэрбамила - поляризация флуоресценции. Чувствительность

определения 2,2 х 1 IV барбамила в моче.

Таким образом, предлагаемый способ получения позволяет повысить чувствительность определения барбамилэ в 2,5 раза, а % перекрестных реакций уменьшить с 100

до 8%.

. Формула изобретения

Способ получения конъюгированных производных барбитуровой кислоты для им- мунохимического анализа бзрбамила взаиг,18321226

модействием производного барбитуровойпользуют 5-изоамил-5-(5 -кзрбоксипенкислоты с белковым соединением при ще-тил)барбитуровую кислоту, в качестве беллочном рН в среде органического раствори-кового соединения - бычий сывороточный

теля, о т л и ч а ю щ и и с я тем. что в качествальбумин и процесс ведут при рН 8-9 и

производного барбитуровой кислоты ис-5 температуре 0-10°С.

Использование: в качестве реагента для иммунохимического анализа барбамила. Сущность изобретения: продукт конь юг эт 5-и зо ам и л -5 -(5 -к ар бокс и пен - тил)барбитуровой кислоты и бычьего сывороточного альбумина. Реагент 1:5- и з о а м и л - 5-(5 -к а р б о к с и п е н т и л) барбитуровая кислота. Реагент 2: изобутилхлорформиат. Реагент 3: бычий сывороточный альбумин. Условия процесса: в диоксане при рН 8-9 и температуре 0-10°С. Ё