Способ получения конъюгатов полициклических ароматических углеводородов с белками Советский патент 1985 года по МПК A61K39/00 

: со 4;

:о

X) 11 Изобретение относится к иммунохИ мин, конкретно к способу получения конъюгированных антигенов (полициклический ароматический углеводород антигенный носитель), которые могут найти применение в медицине и биологии для получения антител к канцерогенным полициклическим ароматическим углеводородам (ПАУ), нейтрализации кан дерогенного действия ПАУ и для определения концентрации и локализации ПАУ в жидкостях и тканях организма. Известны способы получения конъюгатов белков с различными полимерами ij . Однако они не предназначены для связывания белков с растворимым ПАУ„ Наиболее близким к изобретению по технической сущности к достигаемому положительному эффекту является способ получения конъюгатор полициклических ахроматических углеводородов с белками, включающий активацию углеводородов и их ковалентное связывание с белками. Активация углеводородов заключается в получении изоцианатных производных .и их отделении от реакционной смеси, затем изоцианатные производные углеводородов вво дят в реакцию с белками 2. Недостатками этого спосо ба являютс длительность и трудоемкость процесса Реакционноспособное производное ПАУ получают в несколько стадий. В ходе синтеза необходима очистка промежуточных производных, применение большого количества растворителей, концентрированных кислот и токсичных веществ (фосген), Целью изобретения является упрощение процесса получения целевого продукта. Поставленная цель достигается тем способом получения конъюгатов полициклических ароматических углеводоро дов с белками, включающим активахшю углеводородов и их ковалентное связывание с белками, активацию углеводородов проводят в присутствии белка, солей двухвалентного железа и перекиси водорода при соотношении компонентов 1:5:0,06:5,4 - 1:5:2:20 соответственно или белка, пероксидаз и перекиси водорода при соотношении компонентов 1:1,5:0,3:0,35 - 1:5:5:1 при рН 7,4-8,0. Сущность.способа заключается в использовании для активации свобод8ных радикалов. Ре.актив Феитона (смесь солей двухвалентного железа и перекиси водорода и пероксидаза генерируют гидроксильный или супероксиданионный радикалы, способные окислять и гидроксилировать различные органические соединения. В присутствии этих реагентов углеводороды связываются ковалентно с антигенным носителем. Различие между двумя вариантами заключается только в том, что для генерирования свободных радикалов во втором случае используется . не реактив Фентона, а фермент. При осуществлении способа по первому варианту к водному раствору белкового антигенного носителя fpti 5-8), добавляют углеводород, соль двухвалентного железа и перекись водорода в указанном соотношении Смесь перемешивают при в течение 24 ч. Полученный конъюгиро- ванный антиген очищают фильтрацией и гель-хроматографией на сефадексах. Содержание углеводородов в конъюгированных антигенах определяют спектрофотометрически по интенсивности поглощения в области 30000-24000 по сравнению с эталонными растворами ПАУ. В зависимости от соотношения компонентов реакции получают конъюгированные антигены, содержащие 114 моль ПАУ на 1 моль белка. Для получения конъюгированных антигенов ПАУ-антигенный носитель по второму варианту предлагаемого способа к 0,5%-ному водному раствору антигенного белкового носителя (рН 7-8) по каплям при перемешивании вносят раствор ПАУ в диоксане, водный раствор пероксидазы хрена и перекись водорода в указанном весовом соотношении. Смесь перемешивают при в течение 10 мин, затем , очищают от низкомолекулярных продуктов реакции и пероксидазы хрена хроматографией на акрилексе П-60. Количество ПАУ в конъюгированном антигене определяют спектрофотометрически по интенсивности поглощения в области 30000-24000 . В зависимости от соотношения компонентов реакции получают конъюгированные антигены, в которых с одной молекулой белкового носителя ковалентно связаны 1-2 молекулы ПАУ. При осуществлении предлагаемого способа, по сравнению с известным достигается значительное упрощение технологии (проведение реакции в одну стадию вместо четырех без очистки и вьщеления промежуточных продуктов, исключение целого ряда реагентов и растворителей, убыстрение процесса в 3-5 раз). Это возможно в результат использования нового приема активирования ПАУ для присоединения их к белку, которое, осуществляется непосредственно в присутствии белка, без выделения промежуточного реакционноспособного производного ПАУ. Соотношения ПАУ, белкового носителя и веществ, используемых для активирования ПАУ (реактив Фентона или пероксидаза хрена в смеси с перекисью водорода), выбрано в таких пределах, при которых образуется конъюгированный антиген оптимального качества, т.е. содержащий 2-20 моль ПАУ на 1 моль белка. При меньшем количестве ПАУ в конъюгатеухужшаются его антигенные свойства, при большом замещении возможны нежелательные побочные эффекты при иммунизации .животных, кроме того, ухудщается растворимость конъюгатов. Выбранный интервал температур и величина рН позволяют проводить реакцию конъюгирования с достаточной скоростью при стабильности белкового носителя. Пример 1. Способ получения .конъюгированного антигена метилхолан трер-бычий сывороточный альбумин. 50 мг бычьего сывороточного альбу мина растворяют в 2 мл фосфатного буфера рН 7,4 и 3 мл воды, добавляют 10 мг (3810 М) метилхолантрена, 0,63 (5-10 M)FeS04 - 7Н20 и 0,165 мл 1,321СГ5м 33%-ной перекиси водоро да. Смеешь перемешивают при комйатной температуре в течение 4 ч. Полученный конъюгированный антиген метил холантрен- бычий сывороточный альбумин очищают фильтрацией и гель-хроматографией на сефадексе G-25. С одной молекулой белка в конъюгате по данным спектрометрии ковалентного связано 14 молекул метилхолантрена. Пример 2. Способ получения конъюгированного антигена метилхолантрен- бычий сывороточный альбумин. 50 мг бычьего сывороточного альбумина растворяют в 3 мл воды и 2 мл ацетатного буфера рН 8,0. К раствору добавляют метилхолантрен, соль железа и перекись водорода в соотношении, указанном в примере 1, дальнейшую обработку реакции проводят аналогич1384 но примеру I. Получают конъюгированный антиген, в котором с одной молекулой белка ковалентно связаны 2 мо лекулы метилхолантрена. Пример 3. Способ получения конъюгированного антигена метилхолантрен - человеческий сывороточный альбумин. 50 мг человеческого сывороточного альбумина растворяют в 3 мл воды и 2 мл фосфатного буфера рН 7,4. К раст вору добавляют 10 мг (3810 М) метилхолантрена, 20 мг (1,) FeS04- 7Н20 и 0,6 мл (510- М) 33%ной перекиси водорода. Смесь перемешивают 24 ч при комнатной температуре, после очистки на сефадексе G-25 получают конъюгат, в котором с одной молекулой белка ковалентно связа но 5 молекул метилхолантрена. Пример 4. Способ получения конъюгированного антигена метилхолантрен - бычий сывороточный альбумин. 15 мг бычьего сывороточного альбумина растворяют в 2.мл фосфатного буфера, рН 7,4 и по каплям при перемешивании добавляют раствор 3 мг метилхолантрена в 0,1 мл диоксана. К полученной смеси добавляют 15 мг пероксидазы хрена в 0,5 мл фосфатного буфера и 1 мл 3,5%-ной перекиси водорода. Реакционную массу перемешивают 10 мин при комнатной температуре, образовавшийся конъюгат очищают на акрилексе П-60. По данным спектрофотометрии полученный конъюгат метилхолантрен - бычий сывороточный альбумин содержит 2 моль метилхолантрена на 1 моль белка. Пример 5. Способ получения конъюгированного антигена бензпирен бычий сывороточный альбумин. К раствору 15 мг бычьего сывороточного альбумина в 3 мл фосфатного буфера рН 7,4 добавляют 10 мг 4,) 3,4-бензпирена в минимальном количестве диоксана, 3 мг пероксидазы хрена.в 0,5 мл фосфатного буфера и 0,5 мл () 3,5%-ной перекиси водорода. Смесь перемевшваю 10 мин и очищают конъюгированный антиген бензпирен - бычий сывороточный альбумин хроматографированием на акрилексе П-60. По данным УФ-спектра в полученном конъюгате 2 моль бензпирена связаны с 1 моль белка. Пример 6. Способ получения конъюгированного антигена бензпиренчеловеческий сывороточный альбумин,

91

К раствору 15 мг человеческого .сывороточного альбумина в 3 мл фосфатного буфера рН 7,4 добавляют 10 мг (4,210Гм) 3,4-бензпирена в мниимальном количестве диоксана, 3 кг пероксидазы хрена в 0,5 мл фосфатного буфера и 0,1 мл (6-10 М) 3,5%-ной пе.екиси водорода. Смесь перемешиваю1 10 мин при комнатной температуре н очищают крнъюгнрованный антиген ёензпирен - человеческий сывороточный .ьбумин хроматографией на анрилексе П-60. По данным УФ-спектров в полученном кон-ьюгированном антигене с 1 моль белка ковалентно связан 1 моль бензпирена.

Таким образом,- в предлагаемом способе получения конъюгированных с

394386

белками ПАУ по сравнению с известным существенно упрощена технология процесса. В известном способе конъюгат ПАУ-белок получают в четыре стадии 5 в течение 1О-П дней, а в данном реакционноспособное произяодство ПАУ генерируют в присутствии антигенного носителя, поэтому процесс получения конъюгированного антигена дрохо0 дит в одну стадию в течение 2 дней. Отпадает необходимость выделения и очистки промежуточных производных, .исключается целый ряд реагентов и растворителей (концентрированные азотная, соляная, уксусная кислоты, хло{шд олова, концентрированный раствор аммиака, бензол, толуол, лигроин)7 в том числе токсичный реагент - фосген..

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИО КОНЬЮГАТОВ ЮЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ С БЕЛКАМИ, включающий активацию углеводородов и их ковалентное связывание с белками, о т л и ч а Ю щ и и с я тем, что, с целью упрощения процесса получения целевого продукта, активацию углеводородов проводят в присутствии-белка, солей двухвалентного железа и перекиси водорода при соотношении компонентов 1:5:0,06:5,4 - 1:5:2:20 соответственно или белка, пероксидазы и перекиси водорода при соотношении компонентов 1:1,5:0,3:0,35 - 1:5:5:12 при рН 7,4-8,0. (Л