Способ разделения липидов рыбьегожиРА HA фРАКции Советский патент 1981 года по МПК G01N33/92 

(54) СПОСОБ-РАЗДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ РЫБЬЕГО ЖИРА НА ФРАКЦИИ

колонки этилового эфира и метанола позволяет элюировать нейтральные липиды и фосфолипиды. Для элюирования неэстерифидированных жирных кислот, адсорбированных на силикагеле,применяют 2% раствор муравьиной кислоты в эфире. Это позволяет получить хро- 5 матографически чистую фракцию неэстерифицированных жирных кислот.

Применение для элюирования фракции нейтральных липидов и фосфолипидов на второй хроматографической ко- Q лонке в качестве растворителей смеси . гексан-диэтиловый эфир в определенных соотношениях с воэрастаюшей долей полярного компонента (за счет последо.вательного увеличения количества ди- е этилового эфира) позволяет получать фракции липидов со все возрастающей полярностью. Предлагаемые соотношения растворителей обеспечивают четкое разделение компонентов анализируемой .. смеси. Так, смесь растворителей гексан-диэтиловый эфир, взятые в соотношении 98:2, позволяет выделить наименее полярную фракцию - эфиры стеринов. Промывание колонки этой же смесью растворителей, но взятой в 25 соотношении 90:10, где увеличена доля полярного компонента (диэтилового эфира), позволяет выделить более полярную, по сравнению с предыдущей фракцией, фракцию триглицери- 30 дов, Использование же вышеуказанной системы растворителей в соотношении 80:20 еще более увеличивает полярность смеси и позволяет выделить близкие по полярности фракции холе- 35 стерина и диглицеридов. Промывание хроматической колонки только диэтиловым эфиром в количестве 100-120 мл позволяет элюировать моноглицериды наиболее полярную фракцию. В послед- ... нюю очередь хроматографическую колонку промывают системой растворителей хлороформ-метанол (в соотношении 20:80), что обеспечивает выделение полярных липидов (фосфолипидов).

Пример. В качестве объекта 45 исследования берут навеску липидов медицинского рыбьего жира в количестве 80 мг, растворяют в 2 мл хлороформа и наносят на колонку 1. Предварительно выполняют подготовку ко- 50 лонки 1, а именно: хроматографическую стеклянную колонку диаметром 1,2 см, высотой 30 см заполняют силикагелем, предварительно обработанным следующим образом: силикагелБ для колоночной 55 хроматографии обрабатывают 0,5 н. раствором едкого натра путем настаивания в течение 12 ч. Затем промывают водой до нейтральной реакции (по фенолфталеину), высушивают на воздухе и активируют при температуре в течение 12 ч. Навеску обработанного щелочью силикагеля в количестве Б г суспендируют в 20 мл гексана и переносят в хрюматографическую колонку. Для стабилизации ко- 65

лонки пропускают 100 мл гексана под давлением. 2 мл раствора липидов в хлороформе наносят на подготовленную щелочную хроматографическую к6лонку и ггосле поглощения раствора верхним слоем сорбента начинают раз деление липидов на фракции. Вначале отделяют неэстерифицированные жирны кислоты от нейтральных липидов и фосфолипидов, пропуская через хрома тографическую колонку этиловый эфир в количестве 200 мл, который элюирует нейтральные липиды и часть фосфолипидов . Затем через колонку пропускают метанол в количестве 100 мл который освобождает неэстерифицированные жирные кислоты от фосфолипидо Скорость элюирования составляет 2-3 мл в мин под давлением. Полученные элюаты, содержащие нейтральные и полярные (фосфолипиды) липиды, объединяют и растворители отгоняют- под вакуумом. Остаток липидов перерастворяют в 2 мл гексана и подвергают дальнейшему разделению на второй хроматографической колонке.

Неэстерифицированные жирные кислоты, адсорбировавшиеся на щелочном силикагеле в виде солей, извлекают с первой хроматографической колонки

путем промывания ее 120 мл 2% раст,вора муравьиной кислоты в эфире.За тем растворитель отгоняют под вакуумом, остаток перерастворяют .в минимальном количестве хлороформа (0,5 мл) и используют для дальнейшего анализа. Смесь нейтральных липидов и фосфолипидов, освобожденную от неэстерифицированных жирных кислот, подвергают дальнейшему фракционированию на второй хроматографической колонке. Подготовку второй хроматографической колонки осуществляют следующим образом: 5 г силикагеля для колоночной хроматографии активируют при в течение 12 ч, суспендируют в 20 мл гексана и взвесь переносят в стеклянную хроматографическую колонку диаметром 1,2 см, высотой 30 см. Хроматографическую колонку кондиционируют путем пропускания 100 мл гексана.

Смесь нейтральных липидов и фосфолипидов, растворенную в 2 мл гексана, полученнук) с первой хроматографической колонки, наносят на вторую хроматографическую колонку. После поглощения раствора липидов верхним слоем сорбента приступают к элюированию фракций.

Вначале колонку промывают 100 мл .смеси гексан-двэтиловый эфир (98:2) под давлением так, чтобы скорость элюирования составляла 2-3 мл/мин, собирая первую фракцию на выходе из колонки, вторую фракцию цолучают путем пропускания через хроматографическую колонку 120 мл смеси гександизтиловый эфир (90:10). Промывая колонку 120 мл смеси гексан-диэтиловый эфир, взятых Б соотношении 80:20 получают третью фракцию. Затем через хроматографическую колонку пропу |кают 120 мл диэтилового эфира, собирая четвертую фракцию. В последнюю очередь колонку промывают 100 мл сме «си хлороформ-метанол (20:80) и получают пятую.фракцию. Все полученные элюаты поочередно концентрируют путем отгонки раствори теля под вакуумом и используют в дальнейшем анализе. Для идентификации полученных фракций, их чистоты и качества разде ления используют метод тонкослойной хроматографии на закрепленном слое силикагеля, используя стеклянные пластинки размером 9x12 см. Пред;1агаемый пособ обеспечивает возможность повышения точности раз.деления липидов рыбьего жира на фрак ции, что улучшает качество и чистоту получаемых фракций.

Формула изобретения

Способ разделения липидов рыбьего жира на фракции путем нанесения его

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Жейтс М. Техника липидологии. М., 1975, с. 121-135. на силикагель с последукицим элюированием фракций липидов органическими растворителями-, отличающийс я тем, что, с целью повышения точности способа, силикагель предварительно обрабатывсцот раствором щелочи, из нанесенного образца последовательно вначале этиловым эфиром, затем метанолом элюируют смесь нейтральных липидов и фосфолйпидов, после чего 2% раствором муравьиной кислоты в эфире элюируют неэстерифицированные жирные кислоты, далее смесь элюатов нейтральных липидов и фосфолйпидов концентрируют, помещают йа силикагель смесью гексана с диэтиловым эфиром, взятых в соотношении 98:2, элюируют фракцию эфиров стеринов,после чего теми же элюэнтами в соотношении 80г20 э;поируют холестерин и, диглицериды, из оставшегося на силикагеле адсорбата вначале диэтиловым эфиром вымывают моноглицерйды, а затем смесью хлороформа и метанола в соотношении 20:80 элюируют фракцию фосфолйпидов.