СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯЦЕЛЛЮЛОЗЫ И ЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ МЙКРОСРГАНИЗМОВ Советский патент 1981 года по МПК G01N33/46 

Изобретение огносигся к аналитической химии, а именно к способам количественно го ощэеделения целлюлозы и целлюлозных микроорганизмов. Известен способ количественного огфе деления целлюлозы, основанный на обработке анализируемой пробы смесью уксус- ной, .концентрированной азотной и грихлор- уксусной кислот при кипячении с последую щим определением целлюлозы весовым методом Til. Недостатки способа - длительность н сложность обработки, низкая избирательность определения. Наиболее близким к предлагаемому является способ количественного определения целлюлозы и целлюлозных микроорганизмов путем обработки анализируемой пробы микроорганизмомЗОУапЧв У себВибоэипх при 274; и рН среды 7,0 с последующей обработкой полученной смеси реактивом Шамоди-Нельсона и спектрофотометрированием .полученного при этом сжрашенного раствора 121. Недостатки способа - длигельность определения (5суг) и низкая чувствительность (3 мг/мл). Цель изобретенва - повышение чувстьвительности и сокращение времени определения. Поставленная цель достигается способом колнчесгвенксаго определения целлюлозы и целлюлозных микроорганизмов путем обработки анализ(фуемсй пробы микроорганизмом Soran 5 um сеЕЕоВозит с последующей офаботксЛ Полуниной смеси реактивом Шамоди-Нельсона и спектрофотометрироюанвем получеаного окрашенного раствора, при этом обработку-осуществляют фильтратом SorancQium сеЕВиЕч)еипп при рН среды 3-5 в температуре 40-45 С. Построевве калвбровочвого графика целлюлозы. В пробирку помещают порошок целлюлозы (0,1-225 мг) и заливают 10 мл фильтрата купьгуральнс жидкости бактерии Soranqj,um ceERueosym , выращенной на среде Хетчинсона при и интен3. снвной иэрацин, и содержащей в 1 мл 1 млрд клеток. Смесь энергично перемешиваюг, доводят рН до 4,О путем добавления О,О5 мл (1 капля) концентрированной соляной кислоты и термостагируют при 40®С в течение 1 ч. Отбирают 1 мл смеси и определяютобразовавшиеся в ре- зульгаге ферментативного гидролиза реду пирующие сахара по методике ШамодиНельсона, Методика Шамоди-Нельсона, Метод основан на реакции окисления моносахаридов под действием солей двухвалентной меди в щелочной среде; Си + + восстановленный сахар + окисленный сахар. В свою очередь, закись меди восстана ливает арсено-молибдат с образованием молибденовой сини. По поглощению, полученного окрашенного раствора судят о ко ценграции редуцирующих Сахаров. Реактивы. 1. Раствор Шамоди. . Раствор 1-12 г тартрата натрия 24 г Na-pC (безводного), 16 г N аНСОд и 14,4 г W a2.S О4 растворяют в воде и до водят до 8ОО МП, Раствор 2,4 г CuSO-j- 5Н,-р и 3,6 г . растворяют в 2ОО мл. Перед употреблением соединяют четыр объема раствсра 1 и один объем раствора 2, Раствор не должен облучаться солнечным светом. 2, Реактив Нельсона. 25 г молибдата аммония растворяют в 45О мл воды, добавляют 21 мл концентр фованной рерной кислоты и 3 г мышьяковокислого натрия в 25 мл дистиллированной воды, соединение доводят до 500 м Раствор вьшерживают 48 ч при 37°С. Определение осуществляют следующим образом. В специальные пробирки из термостойкого стекла на 1О мл вносят 1 мл испытуемого раствора и добавляют 1 мл растaqja Шамойи, Пробирки помещают в кипящую водяную баню на 15 мин, затем охлаждают и добавляют 1 мл реактива Нельсона, доводят днстиллированной водой до метки, закрывают пробкой и снова.перемешивают. Растворы колсриметрируют на спектрофотометре СФ-16 при в кювете с длиной грани 5 мл. Раствором сравнения служит дистиллированная вода. Данные для построения калибровочной кривой определения глюкозы приведены в табл. 1 { ). 3й лица Результаты для построения калибровочного графика определения целлюлозы представлены в табл. 2. Таблица 2 Пр имер 1. В пробирку помещают 5О мг порошка целлюлозы и заливают 10 мл фильтрата культуральной жидкости бактерии Зог(( ceERoBosuni, вьфащенной на среде Хетчинсона при 27°С и интенсивной аэрации, и содержащей в 1 мл 1 млрд клеток (концентрация целлюлозы 5 мг/мл). Смесь энергично встряхивают, доводят рН до 4,о; путем добавления 1 капли (0,О5 мл) концентрированной соляной кислоты и термостатируют при в течение 1 ч. Отбирают 1 мл смеси и определяют образовавшиеся в результате ферментативного гидролиза редуцирующие сахара методом Шамоди-Нельсона. Находят по ранее построенному калибровочному графику, что в результате ферментативного гидролиза образовалось 0,1 мг/мл глюкозы. Известно (табл.2), что данное количество редуцирующих Сахаров и соответствует содержанию целлюлозы в анализируемой смеси 5 мг/мл. П р имер 2. Для определения целлюлозы используют фильтрат культуральной жидкости целлюлозной бактерии Soroiint iorn oeE.Bueosorn (ВКМ В-644), вьфащенной при и интенсивности аэрации на среде XeT4HHcoHa(K,iP04 1г, СаСВа ОД г, О,3 г , НаСе 0,1 г, РеСе-з 0,01 г, NaHOj 2,5 г, целлюлоза 5 мг/мл, вода 100О мл), и содержащей в 1 мл 1 млрд клеток.

Анализируемую пробу заливают 1О мл фильграга, доводят рН до 4,0 и гермосгатируют при в течение 1 ч. Образовавшиеся редуцирующие сахара определяют по методике Шамоди-Нельсона н по предварительно построенному калибровочному графику зависимости редуцирующей способности от концентрации целлюлозы; При удельной активности целлюлозы в фильтрате 8,5 ф.е. на 1 мг белка можно опредёлить 0,01-22,5 мг/мл целлюлозы.

Результаты определения целлюлозы приведены в табл. 3 ( 5; ,95).

Таблица 3

П р и М е р 4. Способ осуществляот аналогично примеру 1, но при проведении ферментативного гидролиза рН среды соответствует 3,О-5,О„

Зависимость пределов обнаружения целлюлозы от рН среды при проведении ферментативного гидролиза представлена в табл. 5.

Таблица 5

П р и м е р 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но термостатирование проводят при ЗО-5О°С.35

Зависимость пределов обнаружения целлюлозы от температурь проведения ферментативного гидролиза представлена BI табл. 4.

Таблица

Из табл. 4 следует, что интервал температур 40-45с является оптимальным при проведении ферментативного гидролиза, так как обеспечивает максимальный днапаз€и определяемых содержаний.

Из табл. 5 видно, что рН среды 4,0 при проведении ферментативнот о гидролиза обеспечивает максимальный диапазон определяемых содержаний.

Предлагаемьй способ позволяет сократить продолжительность определения целлюлозы и целлюлозных микроорганизмов ( с 5 сут до 2 ч при условии постоянного культивирования микpoqэгaнизмoв} с ,5 сут до 2 сут при условии периодическо го культивирования микроорганизмов; обеспечивает достаточную чувствительность (О,01 мг/мл по сравнению с 3 в известном способе) и специфичность определения целлюлозы и целлюлозных микроорганизмов в среде, содержащей другие углеводы и окисляющие их микроорганизмы

Формула изобретения

Способ количественного определения целлюлозы и целлюлозных микроорганизмов путем обработки анализируемой пробы микроорганизмом Sov anqgiUTTV ceBtoBo Urn с последуюнюй обработкой полученной смеси реактивом Шамоди-Нельсона и спектрофотометрировавием полученного окрашенного раствора, отличающийся тем, что, с целью повышення чувствительности и сокращения времени определения, обработку осуществляют фильтратом Soranqf-Jum ceBeufcosumпри рН среды 3-5 и температуре 40-4 5°С.

Источники ушфармапкя,2. Туманов А, А, н др. Биохимическая

nptfflHTbie во внимание при экспертизеиндикация полисахаридов. Целлюлоза. Тру1, Бауэр К,. Анализ органических .сое- ды по химии и химической технологии, д таений,М, 1953, с. 357.вып. 2, 1975, с. 8О-85 (прототип).