ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS SPECIES - ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА И ЦЕЛЛЮЛАЗ Российский патент 1995 года по МПК C12P21/00 C12N9/14 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/66 

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в процессах переработки целлюлозосодержащих материалов для получения микробного белка и комплекса целлюлозолитических ферментов.

Отходы и побочные продукты деятельности в области сельского хозяйства, лесной и пищевой промышленности традиционно утилизируют, сжимая или закапывая в землю. Однако возросшая стоимость транспортировки, уменьшение площади бросовых земель и проблема окружающей среды требуют поиска иных способов утилизации этих отходов.

Известен способ микробиологической переработки отходов растительного происхождения (Даубека Г. А.С. N13001, СССР. Заявлено 01.03.1930), основанный на переработке отходов растениеводства совместным действием выделенных из промывных вод риса бактерий и выделенных с коробочек египетского хлопка дрожжей.

В настоящее время отходы растениеводства широко используются для производства белка, спирта и ферментных препаратов.

Питательная ценность биомассы, полученной в результате микробиологической конверсии отходов, по жировому и белковому содержанию позволяет использовать ее в качестве кормовой добавки для моногастричных животных.

Для микробиологической ферментации растительных отходов используют микроорганизмы различных таксономических групп, таких как Rhizopus arrhizus, Chaetomium utilis, Pichia pinus, Cellulomonas sp., Myrothylophilus met, Merotheceium verrucaria, Trichoderma harzianum, способные утилизировать различные растительные субстраты: солому, багассу, картофельные очистки, банановую кожуру, стружки зеленых бобов, манговую кожуру, мякоть, корки и косточки мандаринов (Albert Sasson Biotechnologies: challenges and promises. - Unesco: 1985).

Известен способ получения кормовой добавки из пшеничных отрубей в условиях твердофазной ферментации с помощью штамма Endomycopsis fibuligera C-4 с добавлением мочевины в ферментационную среду (Авторское свидетельство СССР N 1507787, кл. С 12 N 1/16, 1984).

Известен способ получения обогащенных белком кормов из растительных отходов, увлажненных дрожжевой суспензией с последующей обработкой Trichoderma viridis (Newnaier, Заявка ФРГ N 3340862, кл. А 23 К 1/44, 1985).

Привлекает внимание использование мицелиальных грибов рода Aspergillus для обогащения белком растительных субстратов. Aspergillus orizae используется как продуцент белка в ходе твердофазной ферментации на среде с 32% грубой ржаной ржи и 8% свекловичной пульпы. Выход белка - 32% по сухому веществу (Crajkowske D., Tlnicke-Clejniczak O. "Acta biotechnol" 1988, v.8, N 5, p.405-413).

Для обогащения микробным белком растительного сырья использованы микроорганизмы Aspergillus fumigatus с выходом белка 13,3% на 96 ч ферментации. (Rogers C.J., Coleman E. Spino D.E. Environ Sci. Technol. - 1972, N 6, р. 715).

Микроорганизмы Asp.japonicus способны утилизировать пpедварительно пастеризованную пшеничную солому с выходом белка до 6-8% (Milstein O. Bechar A., Sharagina L., Cresse J. Biotechnol. Let, 1987, v.9, N 4, р. 269-274).

Анализ использованных литературных данных в качестве аналогов показывает, что микроорганизмы разных таксономических групп (Endomycopsis, Trichoderma, Aspergillus) способны использовать в качестве источника углерода целлюлозу различных растительных отходов с обогащением по микробному белку от 6 до 32%.

Необходимо отметить отсутствие в указанных источниках данных о синтезе микроорганизмами других ценных метаболитов.

В ряде работ для получения белковых и ферментных препаратов используют химически обработанные субстраты. Так, для биодеградации кукурузной кочерыжки микроорганизмами Asp.niger AS-101 была проведена предварительная обработка сырья 2%-ной щелочью (NaOH). Выход белка составил 24%; активность по фильтровальной бумаге - 1,7 ед./мл; эндоглюканазная активность - 11,5 ед/мл и глюкозидазная активность - 14,4 ед/мл (Singh A., Abidi A.B., Agrawal A.K., Darmwal N.S. Folia Microbiol, 1989, v.34, p. 479-484).

Однако химическая обработка субстратов приводит к необходимости нейтрализации для уменьшения БПК, поэтому экологически целесообразна прямая конверсия целлюлозосодержащего субстрата.

В качестве прототипа был выбран процесс биоконверсии растительных отходов с помощью микроорганизмов Aspergillus terreus GN1 на соломе сахарного тростника. При глубинной ферментации продуцент кормового белка накапливал до 14,3% белка на третий день (72 ч) ферментации; 0,45 ед/мл эндоглюканазной активности и 0,019 ед/мл активности по ФБ. На седьмой день ферментации было получено 16,4% белка и соответственно 0,55 ед./мл эндоглюканазной активности; 0,027 ед./мл активности по ФБ (Garg. S.K., Neckantan S. Biotechnology and Bioengineering. - 1982, v. 24, р.2407-2417).

Анализируя представленные экспериментальные данные, можно отметить, что штамм микроорганизма, выбранный в качестве прототипа, обеспечивал выход белка 14,3% только на 3 сут ферментации. Ферментативная активность была невысокой на это же время культивирования. Кроме того, в качестве питательной среды при ферментации была использована модифицированная среда Чапека с высоким содержанием по азоту (на литр): 1,4 г кукурузного экстракта (600 мг N)ж 1,0 г КН₂РО₄; 0,5 г КСl. 0,5 г MgSO₄˙7H₂O.

Следует также отметить, что содержание белка в биомассе определяли по Кельдалю (Мс.Kenzic H.A., Wallance H.S. Aust. J. Chem. - 1954, N 17, V.55). Этот метод позволяет определить грубое содержание белка, поскольку направлен на суммарное значение азота в биомассе с последующим пересчетом на белок путем умножения на константу 6,25. При таком определении большая вероятность учета содержания азота питательной среды и недеградирующего субстрата.

Цель изобретения - выделение быстрорастущего штамма рода Aspergillus, способного утилизировать в качестве единственного источника углерода целлюлозу, обладающего более высокой эндоглюканазной активностью и активностью по ФБ, целлобиазной активностью и продуцирующего белок.

Штамм микромицета Aspergillus species ВКПМF-599 депонирован Всесоюзной коллекцией промышленных микроорганизмов при ВНИИГенетика АН СССР 28.03.1991 г., Москва.

Культурально-морфологические признаки
Штамм микромицета Aspergillus species ВКПМF-559 был выделен из сточных вод очистных сооружений Сяського целлюлозно-бумажного комбината.

Идентификация штамма и определение его таксономической принадлежности были проведены по следующим определителям:
Thom C. , Raper K.B., A manual of the Aspergilli - London: Bailliere, Tindal, Cox, 1945, p.373.

Билай В.И. и Коваль Э.З. Аспергиллы. - Киев, Наукова думка, 1988,
Штамм микромицета ВКПМF-559 хорошо рос на большинстве агаризованных средах. Культура микроорганизма образовывала на среде Чапека, сусло-агаре, агаре с бульоном Хоттингера и глюкозой обильный слабосептированный мицелий диаметром 2-6 мкм и репродуктивные структуры, характерные для рода Aspergillus.

Конидиеносцы бесцветные, длина до 260 мкм, диаметр 6-8 мкм до вздутия. Вздутие 16-20 мкм в диаметре. Стеригмы одноярусные, в массе зеленые, диаметром 4-5 мкм.

Агаризованная среда Чапека (Т - 28^оС, 48 ч). Штамм образует округлые колонии зеленого цвета с последующим изменением окраски до темно-серого. Обратная сторона колоний коричневого цвета с пепельным оттенком.

Жидкая среда Чапека (Т - 28^оС, 18 ч).

На жидкой питательной среде штамм образует пеллеты белого цвета, диаметром до 2 мм при культивировании в колбах Эрленмейера n = 220 об/мин.

Агаризованная среда Хоттингера с глюкозой (Т - 28^оС, 72 ч).

Штамм образует колонии округлой формы зеленого цвета с последующим переходом в серый оттенок.

Сусло-агар (Т - 28^оС, 48 ч)
Штамм образует колонии округлой формы темно-зеленого цвета с последующим переходом в серый оттенок.

Агаризованная синтетическая среда Чапека-Докса (Т - 28^оС, 48 ч).

Растворимого пигмента культура микроорганизма не образует, формирует типичные округлые колонии зеленого цвета.

Среда Ван-Интерсона (Т - 28^оС, 120 ч).

Наблюдается образование растворимого пигмента лимонно-желтого цвета.

Физиолого-биохимические признаки
Аэроб. Температурный диапазон от минимальной температуры 10^оС до максимальной температуры 45^оС. Оптимум рН среды при культивировании 4,5-6,2. Aspergillus species ВКМПF-559 хорошо растет на средах с глюкозой, арабинозой, сахарозой, ксилозой, рамнозой, фруктозой, рафинозой, лактозой, мальтозой, инозитом, маннитом в качестве источника углерода.

Желатину не разжижает, молоко не сбраживает, гидролизует крахмал. Пигмент на плотных синтетических средах не образует.

При тестировании на наличие антибиотических свойств методом лунок обнаружено, что микромицет подавляет рост сенной палочки (Bacillus subtilis) и золотистых стафилококков (St. aureus).

Хорошо хранится в лиофилизированном состоянии.

Примеры конкретного использования штамма ВКМПF-559
Посевной материал готовили в жидкой питательной среде Чапека-Докса (II) (концентрация веществ, г/л): KH₂PO₄ 2 NH₄NO₃ 5 MgSO₄ ˙7H₂O 0,5 Глюкоза 10
Ферментацию осуществляли методом глубинного культивирования в колбах Эрленмейера с объемом заполнения питательной средой 100 мл, температурой выращивания 28^оС. Частота вращения вала качающегося устройства 220 об/мин. Время культивирования от 10 до 120 ч.

Посевной материал использовали в количестве 5% от объема ферментационной среды, (г/л): KH₂PO 2 NH₄NO₃ 5 MgSO₄ ˙7H₂O 0,5 Кукурузная кочерыжка 10
Максимальный выход белка (от 15.6 до 17,2%) был достигнут на 18 ч ферментации. По истечении срока культивирования микромицета биомассу собирали путем фильтрации: высушивали в термостате при 50^оС до постоянного веса. В препаратах биомассы определяли содержание белка методом Лоури в сочетании с обработкой грибных клеток по методу Терлихитаровой и Шульги, а также содержании целлюлозы по методу Андеграффа с последующим вычислением степени утилизации целлюлозы. Степень утилизации целлюлоза на 120 ч культивирования составила 83,8%.

Максимальная ферментативная активность была достигнута на 120 ч и составила, ед/мл: Эндоглюканазная 0,85 + 0,08 Активность по ФБ 1,15 + 0,1
Целлобиазная активность 1 + 0,1
Активность по ФБ была определена следующим образом: 50 мг Whatman N 1 (Великобритания) 1х6 см в 1 мл 0,05 М натрий-цитратного буфера инкубировали в течение 1 ч при Т=50^оС. За единицу активности по ФБ принимали активность такого количества фермента, которое за 30 мин действия на 50 мг Whatman N 1 (Великобритания) образует 1 мг редуцирующих сахаров, которые были определены по методу Сомоджи-Нельсона.

Эндоглюканазная активность была определена действием фермента на КМЦ: 0,5 мл 1%-ного раствора Na КМЦ в 0,05 М натрий-цитратном буфере (рН 4,8) и 0,5 мл фильтрата культуральной жидкости инкубировали в течение 30 мин при Т = 50^оС. За единицу эндоглюканазной активности принимали активность такого количества фермента, которое за 30 мин действия образует 1 мг редуцирующих сахаров, количество которых было определено по методу Сомоджи-Нельсона.

Целлобиазная активность была определена следующим образом.

0,5 мл 0,05%-ного раствора целлобиазы в 0,05 М натрий-цитратном буфере (рН 4,8) и 0,5 мл фильтрата культуральной жидкости инкубировали в течение 30 мин при Т = 50^оС. За единицу целлобиазной активности принимали такое количество фермента, которое за 30 мин образует 1 мг редуцирующих сахаров. Количество редуцирующих сахаров было определено по методу Сомоджи-Нельсона.

В результате проведенных исследований было обнаружено, что в биомассе микромицета ВКПМF-559 при выращивании на среде с измельченной кукурузной кочерыжкой синтезируется белок, а фильтрат культуральной жидкости содержит комплекс целлюлозолитических ферментов.

Количественное содержание белка, степень утилизации субстрата и ферментативная активность культуральной жидкости микромицета ВКПМF-559 приведены в таблице.

Таким образом выделенный и описанный нами штамм микромицета Aspergillus species превосходит штамм микроорганизма, выделенный в качестве прототипа по производительности в условиях глубинного культивирования, что выражается в более высокой скорости процесса биоконверсии растительного сырья (18 ч), значительной степени его утилизации и существенной его активности.

Использование быстрорастущего штамма в промышленной микробиологии приведет к значительному снижению уровня энергозатрат и трудоемкости технологического процесса, высвобождению значительной части инженерно-технического персонала, что в конечном итоге приведет к увеличению уровня рентабельности производства.

Использование: биотехнология, кормопроизводство. Сущность изобретения: новый штамм Aspergillus species ВКПМГ-559 - продуцент белка и целлюлаз, способный утилизировать в качестве единственного источника углерода целлюлозы, характеризующийся высокой эндоглюканазной, целлобиазной и активностью по ФБ и 14%-ным выходом белка (на третьи сутки ферментации). Штамм выделен из сточных вод очистных сооружений Сясьского ЦБК, хорошо растет на большинстве из агаризованных сред, аэроб, температурный оптимум 10 - 45°С, рН-оптимум 4,5 - 6,2. Степень утилизации субстрата до 85%. 1 табл.

ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS SPECIES - ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА И ЦЕЛЛЮЛАЗ.

Штамм гриба Aspergillus species ВКПМF-559 - продуцент белка и целлюлаз.