ШТАММ БАКТЕРИЙ STREPTOCOCCUS LACTIS - ПРОДУЦЕНТ НИЗИНА Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 C12P1/04 C12N1/20 C12R1/46 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой, молочной, микробиологической и консервной промышленности в качестве полипептидного консерванта низина. Традиционные способы консервирования пищевых продуктов за счет стерилизации сопровождаются разрушением ценных компонентов используемых продуктов. Снижение потерь пищевых компонентов добавками органических кислот обычно изменяет вкус пищевого продукта. В качестве альтернативы рассматриваются природные пищевые консерванты. Продуцентами низина являются штаммы молочнокислых бактерий Streptococcus lactis. Низин подавляет развитие грамположительных микроорганизмов: стрептококков, стафилококков, сарцин, спорообразующих бактерий, в том числе и термофильную микрофлору. Механизм биологического действия низина связан с нарушением проницаемости бактериальных цитоплазматических мембран. Нарушение мембранного потенциала инициирует образование пор, через которые проходят молекулы бактериоцина. Низин подавляет прорастание спор у ряда бациллярных форм бактерий, что в свою очередь позволяет сократить время термообработки пищевых продуктов при консервировании и предотвращает разрушение витаминов и изменение вкусовых качеств продуктов питания человека.

Известен мутантный штамм Streptococcus lactis ВКПМ В-4591 - продуцент антибиотика низина (авторское свидетельство СССР N 1687616, кл. C 12 P 21/00, C 12 N 1/20, БИ N 40, 1991).

Антибиотическая активность данного рекомбинантного штамма на минеральной среде с глюкозой или мальтозой равна 4000 - 4200 МЕ/мл при времени ферментации 8 - 9,5 ч. Недостатком известного мутантного штамма является относительно низкая активность конечного целевого продукта - низина и недостаточная устойчивость его в производственных условиях. Известен штамм Streptococcus lactis ВКПМ В-6793 - продуцент бактериоцина низина (патент РФ N 2061042, кл. C 12 N 1/20, C 12 P 1/04, C 12 R 1:4, БИ N 15, 1996). Недостатками этого известного штамма являются относительно низкая активность низина - 4800 МЕ/мл и меньший спектр сбраживания сахаров и спиртов.

Наиболее близким по техническому решению и производственным показателям является штамм Streptococcus lactis ВКПМ В-6795 -продуцент бактериоцина низина (патент РФ N 2059716, кл. C 12 N 1/20, C 12 P 1/04, БИ N 13, 1996), который обеспечивает активность 5600 МЕ/мл, продуктивность 2520 МЕ/см³/ч при скорости протока среды Д = 0,45 ч^-1. Недостатками его использования в производстве являются меньший спектр сбраживания углеводов и относительно меньшая активность синтеза низина на гидролизованном молоке.

Задачей изобретения является получение нового штамма-продуцента низина, обеспечивающего высокий выход целевого продукта и активно сбраживающего более широкий спектр различных углеводов и спиртов.

Технический результат заключается в получении конечного целевого продукта - полипептидного консерванта низина с концентрацией в два раза выше - 11500 - 12500 МЕ/мл и в сбраживании, в отличие от прототипа - штамма Str. lactis ВКПМ В-6795, арабинозы, рамнозы, сорбита, глицерина, дульцита.

Штамм Streptococcus lactis 47-28 хранится во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов института ГосНИИгенетика под номером ВКПМ В-7430.

Из музея молочнокислых культур ВНИИМС (г. Углич) были отобраны в периодическом асептическом процессе несколько активных штаммов Streptococcus lactis и проверены в непрерывном процессе при увеличивающейся скорости протока среды (Д = 0,3 - 0,5 ч^-1) в аппарате "Биостат". Второй этап селекции заключался в отборе активных, крупных колоний при высеве образцов с периодического и непрерывного процесса в аппарате на мясо-пептонный агар и агаризованный молочный гидролизат с последующим культивированием в качалочных колбах активного изолята штамма Streptococcus lactis ВКПМ В-7430 на оптимальной жидкой питательной среде и определением низинобразующей способности методом диффузии в агар с тест-организмом Bacillus coaqueans.

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма Streptococcus lactis ВКПМ В-7430:
на мясопептонном агаре образует мелкие, гладкие, блестящие беловатые колонии диаметром 1,5 - 2,0 мм, край колонии гладкий, профиль возвышенный;
на агаризованном молочном гидролизате колонии мелкие, белые, гладкие, блестящие с гладким краем, профиль возвышенный, диаметр колонии 0,8 - 1,5 мм.

Клетки: овальные кокки 1,05 - 1,5, 1,05 - 2,1, 1,2 - 1,4 мкм, в основном образующие пары и цепочки из 4-6-8 клеток.

Бактерии грамположительные, бесспоровые, неподвижные, желатину не разжижают, нитраты не восстанавливают, каталазоотрицательные. Сбраживает из углеводов: глюкозу, фруктозу, галактозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, арабинозу, маннозу, рамнозу, ксилозу; из спиртов - маннит, сорбит, глицерин, дульцит. Не образует индол и сероводород. Молоко быстро свертывает, не пептонизирует, продолжительность свертывания молока при внесении 10% инокулята 14 - 16 ч, кровь не гемолизирует. Факультативный анаэроб, тип брожения - гомоферментативное, температура выращивания 20 - 32^oC, оптимум 30^oC, pH среды 6,5 - 6,8, содержание Г+Ц в ДНК варьирует в пределах 33-42 мол%. Штамм фагоустойчив. Культура хранится в сублимационно высушенном состоянии в ампулах при температуре - 4±2^oC не менее 12 месяцев и в виде молочного сгустка в 12%-ном обезжиренном стерильном молоке с ежемесячным пересевом и хранением в бытовом холодильнике при температуре 4 - 6^oC.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Пример 1. Штамм Streptococcus lactis ВКПМ В-7430 восстанавливают следующим образом: содержимое ампулы вносят в пробирку со стерильным обезжиренным 12% молоком с добавкой 1% дрожжевого автолизата и инкубируют при температуре 30^oC в течение 24 ч, из него делают 3 пассажа. Из последнего пассажа восстановленной культуры готовят инокулят на обезжиренном молоке в пробирках или маленьких колбочках, 10% инокулята вносят в качалочные колбы объемом 750 мл и проводят периодическое культивирование на качалке при 220 об/мин в течение 14 - 16 ч. В качестве питательной среды используют гидролизованное молоко и сыворотку.

Приготовление: сухое обезжиренное молоко разводят водой до содержания сухих веществ 30 г/л, добавляют 20 г/л сыворотки, кипятят, охлаждают до 45 - 50^oC, доводят до pH = 7,2 - 7,5 единиц, вносят протосубтилин, растворенный в небольшом количестве теплой дистиллированной воды из расчета 1 г/л среды. Гидролиз проводят при температуре 45^oC в течение 6 ч. По окончании гидролиза доводят pH среды до 7,0 единиц и стерилизуют 30 мин при 1 ати. Питательная среда может быть использована для качалочных колб и ферментеров. Регулирование pH среды в колбах производится добавкой 10% раствора NaOH. Активность образования полипептидного консерванта низина штаммом Streptococcus lactis ВКПМ В-7430 в периодическом режиме в колбах составляет 10250 МЕ/мл.

Пример 2. Выращивание штамма Streptococcus lactis ВКПМ В-7430 осуществляли в периодическом асептическом режиме в аппарате "Ферматрон" рабочим объемом 50 л в течение 15 ч, при тех же параметрах и составе среды, что указаны в примере 1, засевной материал, полученный в качалочных колбах объемом 750 мл, в количестве 5% вносили стерильно под факелом в аппарат "Ферматрон", регулирование pH производили путем непрерывной подачи 10% раствора NaOH при автоматическом pH статировании. В результате в конце логарифмической фазы роста образуется наибольшее количество низина 11500 - 12500 МЕ/мл. При этих же условиях штамм-прототип Str.lactis ВКПМ В-6795 показал активность 6000 МЕ/мл.

Таким образом, предлагается более активный штамм Str. lactis ВКПМ В-7430, обеспечивающий выход конечного целевого продукта - пищевого полипептидного консерванта низина в два раза выше прототипа - 11500 - 12500 МЕ/мл и сбраживающий более широкий спектр углеводов и спиртов.

Изобретение относится к биотехнологии. Новый штамм Streptococcus lactis ВКПМ В-7430 - продуцент пищевого полипептидного консерванта низина обеспечивает высокую скорость биосинтеза целевого продукта при управляемом периодическом режиме культивирования (активность 11500 - 12500 МЕ/мл). Штамм характеризуется повышенной способностью к сбраживанию различных углеводов и спиртов.

Штамм бактерий Streptococcus lactis ВКПМ В-7430 - продуцент пищевого полипептидного консерванта низина.