Реактив для анализа хроматина иХРОМОСОМ РАСТЕНий Советский патент 1981 года по МПК A01H1/04 

1

Изобретение относится к цитологии и генетике растений и может быть использовано в биологии и сельском хозяйстве для идентификации хромосом на всех стадиях митотического и мейотического деления клеток.

Известны реактивы для анализа хроматина и хромосом растений, содержащие гематоксилин, неорганические соли алюминия, железа, хрома, глицерин, тимол, салициловую кислоту и другие добавки 1.

Анализы с указанными реактивами очень трудоемкие, длительные ио времени, так как требуют проведения предварительной протравы и отмывания избытка красителя под контролем под микроскопом.

Известен также реактив для анализа хроматина и хромосом - «квасцовый гематоксилин караччи, содержащий гематоксилин, сульфат калия, йодноватистокислый калий, глицерин, дистиллированную воду

2.

Однако наличие в составе реактива сильного окислителя - йодноватистокислого калия приводит к дополнительному окрашиванию крахмала в клетке, что мешает анализу хроматина и хромосом за счет уплотнения содержимого протоплазмы. Использование такого реактива требует дополнительной фиксации цитологического

материала уксусиоспиртовыми или хромовыми смесями.

Цель изобретения - ускорение и улучшение окращиваемости препаратов и упрощение анализа клеточных структур.

Поставленная цель достигается тем, что в состав реактива включают гематоксилин, железо-аммиачные квасцы с 45%-ную уксусную кислоту при следующем соотношеНИИ компонентов, вес. %:

Гематоксилин3,90-4,00

Железо-аммиачные квасцы 0,90-1,00 45% -ная уксусная кислота Остальное

Пример. В стеклянную колбу из прозрачного стекла помещают указанное количество гематоксилина и приливают 1/2 часть 45%-ного раствора уксусной кислоты при температуре +20°С. В течение 0,5 ч гематоксилин растворяют при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки. Далее добавляют 1/4 раствора уксусной кислоты и после кратковременного перемешивания постепенно присыпают железо-аммиачные квасцы. При перемешивании в течение 20 мин порциями по 3-4 мл добавляют оставшуюся уксусную кислоту. Реактив «созревает (окисляется) в течение 160 ч в темноте при подогреве при +40°С

в термостате, после чего получают краентель черного цвета. После фильтрации реактив готов к употреблению.

Предложенный способ приготовления реактива не требует предварительной цротравки квасцами и последующей дифференциации исследуемого материала в них. Реактив следует оберегать от возможного избыточного окисления на свету. Хранится он более трех лет в темной банке с притертой пробкой в холодильнике при 0°С. Одну его порцию при приготовлении препаратов хромосом можно использовать три-четыре раза. В зависимости от специфики окрашивания избранного объекта реактив следует разбавлять полтора-два раза 49%-ной уксусной кислотой. Используя предложенный реактив, получают хромосомы черного или темно-синего цвета (в зависимости от рН среды) и прозрачную плазму клетки.

Эффективность предложенного реактива испытывали при изучении морфологии и количества хромосом сельскохозяйственных культур и декоративных растений в период мейоза и митоза соматических тканей.

В качестве объекта для анализа берут пыльники из цветков пшеницы, винограда, хлопчатника, лука, нарциссов и тюльпанов. Пыльник помешают в сосудик (с притертой пробкой), заполненный предложенным реактивом; ацето-железо-аммонийным гематоксилином. Окрашивание ведут в термостате при температуре -|-45°С на протяжении 1-24 ч (в зависимости от плотности тканей изучаемого объекта растения). Предварительно окрашенные пыльники раздавливают на предметном стекле в капле просветляющей, консервируюшей жидкости. Консервирующая смесь состоит на 1/3 из глицерина и 1/3 концентрированного раствора (75%) хлоральгидрата. Раздавленный пыльник накрывают покровным стеклом и изучают под микроскопом. Таким же образом готовят препараты кончиков корешков растений для изучения морфологии и количества хромосом в митотически делящихся клетках соматической ткани.

Препараты сохраняются продолжительное время (до года), что позволяет зарисовать и сфотографировать необходимые хромосомные картины. При этом получают хромосомы черного или темно-синего цвета и прозрачную плазму клеток.

Предлагаемый реактив в сравнении с известным, например с ацетокармином или гематоксилином, исключает наличие брака при приготовлении препаратов, позволяет

сократить хромосомный анализ в сто раз. В то время как в бальзамированных препаратах, полученных с помощью известных реактивов, подсчет хромосом можно провести только после 8-10 дней лабораторной работы, с помощью предложенного реактива для получения одного препарата требуется всего 0,5 ч. Таким образом, за один рабочий день можно приготовить 200-300 препаратов, а по способу-прототипу - только 10-15.

Предложенный реактив может быть использован многократно, улучшает качество визуально наблюдаемых хромосом, что позволяет с большей точностью их фотодокументировать.

Формула изобретения

Реактив для анализа хроматина и хромосом растений, включающий гематоксилин, отличающийся тем, что, с целью улучшения и ускорения окрашиваемости препаратов и упрощения анализа клеточных структур, реактив дополнительно содержит железо-аммиачные квасцы и 45%-ную уксусную кислоту при следующем соотношении компонентов, вес. %: Гематоксилин3,90-4,00

Железо-аммиачные квасцы 0,90-1,00 45%-ная уксусная кислота Остальное Источники информации,

принятые во внимание при экспертизе 1. Лилли Р. Патологическая техника и практическая гистология. М., «Мир, 1969, с. 163-167.

2. Малый практикум по цитологии. Под ред. Ченцова Ю. С. М., Изд. МГУ, 1977, с. 274-275 (прототип).