Способ окрашивания хромосомРАСТЕНий Советский патент 1981 года по МПК A01H1/00 

(54) СПОСОБ ОКРАШИВАНИЯ ХРОМОСОМ РАСТЕНИЙ

t

Изобретение относится к цитологии растений, а именно к технике окрашивания хрсяйосом растений и изготовления давленых препаратов.

Известны способы окрашиванияxjoмосом растений, при которых используют ацёто-карминовые, ацето-лакмо-г идные, ацето-железо-гематоксилиновые красители, производят фиксацию по Карнау, гидролиз в соляной кислоте 1

Однако известные способы не пригодны для окрашивания определенных тасономических групп растений и не всегда позволяют получать ясное представление о морфологии хрсмоссни,

; Известен также способ окрашивания xfiOMocoM шелковицы, при которсчи зафйкйированный по Карнау материал подвергают гидролизу в СОЛЯНОЙ кислоте при различных температурных режимах, после чего промывают в 45%-ной уксус ной кислоте в течение 25-30 мин , окрашивают ацето-железо-гематокоилином при 29-30°С в течение 8-12 ч,, прополаскивают в 45%-ной пропионовой кислоте, помещают в каплю зтой кислоты и готовят давленый препарат 2.

Способ, разработанный для окрашивания метафазных хромосом дишюид-Г лых и полиплоидных форм шелковицы,

применительно к другим растениям, как правило, мало пригоден, хромосомы или окрашиваются в недостаточной степени, или чрезмерно интенсивно, что делает невозможным изучение их морфологии. Материал после окрашивания ацето-железо-гематоксилином зачастую затвердевает, плохо давится или не давится вовсе. Поэтому на изготовленных давленых препаратах клетки плохо распластываются, не получается хорошего разброса хромосом. Последние лежат скученно и не в одной плоскости. Промывание материала от соляной кислоты 45%-ной уксусной кислотой создает некото1иле неудобства в работе, связанные с необходимостью приня тия дополнительных мер техники безопасности по защите от попадания паров кислоты в дыхательные пути исследователя, от загрязнения кислотой рабочего места и т, д.

Цель изобретения - достижение интенсивного и четкого окрашивания хромосом различных растений на фоне б сцветной или слабоокрашенной плазмы на давленых препаратах, обеспечения хорошего распластывания клеток и расположения хромосом разрозненно, в одной плоскости. Поставленная цель достигается те 4to зафиксированный одним из спирто вых фиксаторов, преимущественно по Карнауг растительный материал (лис, точки, корешки, пыльники на стадиях мейоза и т.п.), хранящийся в 70%-ном спирте, посла гидролиза в 1 н соля (ой кислоте в течение 8-12 мин при промывается от НС1 помещением в буферный раствор 2xSSC, (рН 7,0), который представляет собой раствор. содержащий 0,3 М хлористого натрия и 0,03 М цитрата натрия трехзамещенного , на 25-30 мин, который за ука ное время сменяется не менее трех раз. Затем материал помещается в . ацето-железо-гематоксилин при 29-30° от 1-2 ч до 2 сут в зависимости от вида растения. Корешки и пыльники злаков выдерживают в красителе: инжир 1-2 ч, гранат 16-24 ч, виноград 2 сут и т.д. После окрашивания материал промывается от красителя дистиллированной водой 10-15 мин, освобождается- от ненужных частей, помещается в маленьком герметически закрытом сосуде в цитазу на 1,5-3 ч при 20-25°С, промывается от цитазы дистиллированной водой 5-10 мин и готот вится давленый препарат в капле просветляющей жидкости (45%-ной уксусной кислоты, смеси глицерина и насыщенного водного раствора хлоралгидрата и т.п.). Если исследуется растение, хромосомы которого склонны к обесцвечиванию в названных средах то давленый препарат готовится в кап ле 45%-ной пропионовой кислоты. Образцы некоторых растений (например, злаковых) после промывки от цитазы дистиллированной водой выдерживаются 3-10 мин в 45%-ной уксусной кислоте и давленый препарат готовится в капл этой же кислоты. . . При надобности материал в дитазе можно оставлятьДО 1-3 сут в холодил нике без заметного ухудшения качеств изготовляемых препаратов. Изготовленные вьшеуказанным спосо бом препараты различных растений содержат хорошо распластанные клетки с интенсивно и четко окрашенными хро мосомами, расположенными в метафазной пластинке разрозненно и в одной плоскости. Плазма или не окрашиваетсяу или же окрашивается очень слабо -Пример. Корешки проростков пшеницы, эгилопса, ржи и эгилопсаржаного гибрида предобрабатнваем нас щенным водным раствором монобромнафталина в течение 3 ч, промываем в проточной воде 30 мин, фиксируем по Карнау (6:3:1) в течение 24 ч, промываем 96 и 70%-ными спиртами и помещаем в 70%-ном спирте в холодильник. Корешки хранящиеся в 70%ном спирте, переводим в 1н. соляную кислоту при на 10 мин, тщатель но промываем от соляной кислоты-бу ферным раствором 2х SSC(рН 7,0) в течение 25-30 мин, сменяя буфер свежим не менее трех {яез, помещаем в свежеотфильтрованный ацето-железогематоксилин при на 1 ч 40 мин. Затем корешки промываем 10 мин в нескольких сменах дистиллрованной воды, отрезаем кончики корешков длиной 1-1,5 мм, оттягиваем из них излишки воды фильтровальной бумагой и помещаем в небольшую каплю цитазы в маленьком фарфоровом тигле. Тигель с материалом плотно закрываем корковой пробкой и помещаем в термостат с температурой 25°с. Через-1,5-2 кончики корешков по одному вынимаем из цитазы микролопаточкой, осторожно помещаем в дистиллированную воду для удаления цитазы. Через 5-6 мин кончики корешка помещаем на 3-10 мин в каплю 45%-ной уксусной кислоты на предметном стекле, предварительно убрав излишки воды фильтровальной бумагой. Готовим давленый препарат. Пример 2. Корешки укорененных черенков инжира, граната и винограда фиксируем по Карнау (6:3:1) в течение 24 ч, промываем 96%-ным спиртом и храним в 70%-ном спирте в холодильнике. Корешки, хранящиеся в спирте, обрабатываем 10 мин 1 н раствором соляной кислоты при , промываем от НС1 буфером 2xSSC(pH 7,0) в течение 30 мин, трижды сменяя буфер свежим. Затем корешки выдерживаем в ацето-железо-гематоксилине при 30С в течение 20 ч (корешки инжира и граната) и 2 сут (корешки винограда) . После этого их промываем водой в течение 10 мин, осторожно снимаем с кончиков корешков под микроскопом МБС-1 ризодермис с чехликом. Очищенные от ризодермиса и чехлика кончики корешков длиной 1-1,5 мм помещаем в цитазу на 2 ч в маленький фарфоровый тигель, который плотно закрьлваем корковой пробкой и помещаем в термостат с температурой 25с. Через 2 ч кончики корешков по одному вынимаем из цитазы и перекладываем в дистиллированную воду на 5 мин. Затем кончик корешка давим на предметном стекле в капле 45%-ной пропионовой кислоты. Ацето-железо-гематоксилин готовится по известному рецепту: 4 г гематоксилина растворяется в колбе в, 100 мл 45%-ной уксусной кислоты, затем добавляется 1 г железо-аммонийных квасцов. Колба неплотно закрывается ватной пробкой и оставляется в теплом (26-ЗО С),светлом месте на 4-5 сут для созревания красителя. При температуре ниже созревание длится 7-1-0 и более сут. После соз-. ревания краситель фильтруется через бумажный фильтр и хранится в холодильнике. Такой краситель.сохраняет свои красящие свойства около месяца Хромосомы злаковых культур хоровдо красятся и красителем, со времени приготовления которого прошло более чем один месяц. Буфер 2x8SC представляет собой раствор, содержащий 0,3 М хлористо го натрия и 0,03 М цитрата натрия трехзамещенного, рН доводят до 7,0 путем прибавления по каплям 1н соля ной кислоты. Использование предлагаемого способа окрашивания хромосом растений обеспечивает по сравнению с известн ми способами исключительно четкое, интенсивное окрашивание хромосом ра личных растений на фоне бесцветной или слабоокрашенной плазмы, в том числе, интенсивное и четкое окрашивание хромосом на фоне слабоокрашенной плазмы даже у тех растений, хромосомы которых всеми известными спо 5с1ми окрашиваются явно неудовлетворительно (например, у винограда, инжира, граната и т.д.); избирательность в окрашиваниии соматических метафазных хромосом различных растений , облегчающую исследованием морфологии этих хромосом и их идентификацию; несравненно лучшее распластывание клеток в давленых препаратах с расположением хромосом разнозненно и в одной плоскости; избавление иссл дователя от мер предосторожности, связанных с опасностью загрязнения рабочего места концентрированной уксусной кислотой и попадания паров этой кислоты в дыхательные пути. При регулярно проводимой круглогодичной цитологической работе эта опасность особенно велика. Применение буфера 2х SSC вместо 45%-ной уксусной кислоты имеет еш,е то преимущество, что при этом лучше выявляются центромеры в.торичные перетяжки, спутники, а также двуххроматидная структура каж-. |дой хромосомы. формула изобретения Способ окрашивания хромосом растений, включающий фиксацию спиртовым фиксатором, гидролиз в 1 н растворе НС1 при бО-С и окрашивание ацетожелезо-гематоксилином, отличающийся тем, что, с целью достижения интенсивного и четкого окрашивания хромосом различных растений на фоне бесцветной или слабоокрашенной плазмы на давленых препаратах, обеспечения хорошего {эаспластывания клеток и расположения хромосом разрозненно, в одной плоскости, окрашиваемый материал после спиртовой фиксации и гидролиза промывают от НС1 не менее трех раз буферным раствором 2xSSC в течение 25-30 мин, выдерживают в ацето-железо-гематоксилине при 29-30°С от 1-2 ч до 2 сут в зависимости от вида растения, после чего промывают 2-3 р в течение 10-15 мин дистиллированной водой, помещают в цитазу на 1,5-3 ч при 20-25-с в герметически закрытых сосудах, проМывают от цитазы дистиллированной водой, в течение 5-2П мин, выдерживают в 45%-ной уксусной кислоте в течение 3-10 мин и готовят давленый препарат в капле этой же кислоты. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Паушева 3.П. Практикум по цитологии растений. М.,Колос, 1974, с. 119-127, 176-181: 2.Авторское свидетельство СССР № 652931, кл. А 01 Н 1/00, 1977 (прототип) .