Способ подготовки ооцитов крупного рогатого скота для анализа Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к способам фиксации и окрашивания женских половых клеток крупного рогатого скота до и после культивирования в среде.

Изобретение может найти применение при культивировании половых клеток.

Известен способ фиксации и окрашивания половых клеток экспериментальных животных (мыши, крысы) по методу Чанга. Фиксирующий раствор состоит из воды:метанола:формалина в соотношении 1:1:1, фиксация проводится в течение 40-60 минут, затем переносят в охлажденный этиловый спирт на 1 ч, после чего клетки переносят на предметное стекло и окрашивают лакмоидом 0,12% в уксусной кислоте, покрывают покровным стеклом и производится анализ хроматина под фазовым контрастом.

Данный способ не эффективен для ооцитов крупного рогатого скота, т.к. они более крупных размеров d 130-150 мкм (у мышей, крыс - 60-80 мкм) и обладают высоким содержанием липидных капель, а

это делает невозможным анализ состояния ядра и хромосом.

Целью изобретения является контрастирование ядра и хромосом ооцитов крупного рогатого скота до и после культивирования, сокращение времени просмотра.

Указанная цель достигается тем, что в предлагаемом способе изменяется соотношение частей 2:1:1 фиксирующего раствора вода:метанол:нейтральный формалин, время фиксации 2 часа, концентрация лакмоида 0,24% в 45% уксусной кислоте с добавлением генцианового фиолетового 0,002% раствора.

Сопоставительный анализ заявленного способа с прототипом показывает, что заявленный способ отличается от известного, тем что изменяется соотношение компонентов фиксатора, длительность фиксации и способ окрашивания. Таким образом, заявленный способ соответствует критерию изобретения новизна.

VJ

О CJ

о

00

Известен способ фиксации и окрашивания половых клеток мышей и крыс в котором используется фиксирующие растворы и окрашивание ядра и хроматина. Однако, при указанном способе не удается увидеть ядро и хромосомы в ооцитах крупного рогатого скота и велики потери клеток, затраты времени и труда при просмотре препаратов, которые исключаются в заявленном техническом решении. Это позволяет сделать вывод о его соответствии критерию существенные отличия.

Примеры конкретного выполнения.

Готовили фиксирующие растворы состоящие из воды:метанола:нейтрального формалина. Были взяты три группы фиксирующих растворов. Первая группа - фиксирующие растворы в соотношении 1:1:1. Раствор разливали в три чашечки: время фиксации 1 ч, 2 ч и 3 ч. Вторая группа: соотношение 2:1:1, растворы тоже разливали в три чашечки: время фиксации 1 ч, 2 ч и 3 ч. Третья группа - соотношение компонентов 3:1:1, растворы также разливали в три чашечки, время фиксации 1 ч, 2 ч и 3 ч. Все чашечки сверху надписывали и ставили в холодильник на 60 минут. Затем готовили окрашивающие растворы из лакмоида в концентрации 0,24% в 45% уксусной кислоте и ген циановый фиолетовый 0,002% раствор.

Половые клетки - ооциты до и после культивирования, освобождают от клеток кумулюса и пастеровской пипеткой переносят в охлажденные фиксирующие растворы. Через час брали из первой группы чашечку № 1. зафиксированные клетки переносили в охлажденный 96% этиловый спирт, из второй группы брали чашечку № 1 и клетки переносили в спирт, и из третьей группы чашечку № 1, клетки тоже переносили в спирт. Все чашки ставили в холодильник на 1 ч или на ночь.

По истечению двух часов фиксации из первой группы брали чашечку №2, зафиксированные клетки переносили в охлажденный 96% этиловый спирт, из второй группы брали чашечку № 2: клетки тоже переносили в спирт, и из третьей группы чашечку № 2, клетки также переносили в спирт. Все три чашечки ставили в холодильник на час или

на ночь.

Составитель С.

Редактор Т. Куркова

Техред М.Моргентал

Через три часа фиксации из первой группы брали последнюю № 3 чашечку и зафиксированные клетки переносили в охлажденный 96% этиловый спирт, из второй

группы брали чашечку № 3 и клетки переносили в спирт, и из третьей группы брали чашечку № 3, клетки также переносили в спирт. Все три чашечки ставили в холодильник на час или на ночь.

После фиксации ооцитов всех трех групп готовили тотальные препараты. Пастеровской пипеткой ооциты переносили на обезжиренное предметное стекло, окрашивали 1 каплей раствора лакмоида 0,24% рзствор в 45% уксусной кислоте и 1 каплей 0,002% раствором генцианового фиолетового, покрывали покровным стеклом и готовый препарат просматривали под фазовым контрастом фотомикроскопа МБЙ-15.

Анализ состояния окрашивания хромосом и ядер, показал наиболее оптимальный вариант для ооцитов крупного рогатого скота вторая группа фиксирующего раствора вода:метанол:нейтральный формалин в соотношении 2:1:1, время фиксации 2 часа. Уменьшение концентрации фиксатора водой создает большую гипотонию, которая вызывает набухание клеток и увеличение размеров пор, через которые проходят красители и улучшается окрашивание структур ядра.

Использование заявляемого изобретения позволит:

- анализировать состояние ядра, хромосом в ооцитах крупного рогатого скота; -сократить время просмотра клеток. Формула изобретения Способ подготовки ооцитов крупного рогатого скота для анализа, включающий

фиксацию ооцитов в смеси воды, метанола и формалина, обработку охлажденным этиловым спиртом с последующей окраской смесью лакмоида и уксусной кислоты, отличающийся тем, что, с целью

повышения разрешающей способности анализа, воду, метанол и формалин в смеси используют в соотношении 2:1:1, фиксацию проводят более двух часов, смесь для окрашивания дополнительно содержит 0,002%

раствора генцианового фиолетового, лакмо- ид используют в концентрации 0,24%, а уксусную кислоту - в концентрации 45%.

ражнова

Корректор 3. Салко

Использование: цитология, фиксация и окрашивание женских половых клеток крупного рогатого скота. Сущность изобретения: ооциты фиксируют в смеси воды, метанола и формалина, взятых в соотношении 2:1:1 в течение более 2 ч, после чего обрабатывают охлажденным этиловым спиртом и окрашивают смесью лакмоида, уксусной кислоты и генцианового фиолетового.