Способ приготовления давленых препаратов хромосом хлопчатника Советский патент 1981 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к цитологии и селекции растений и может быть использовано в сельском хозяйстве. Известны способы приготовления давленых препаратов хромосом растений: ацето-карминовый, ацетолакмоидный, ацето-арсеиновый, ацето-железогематоксилиновый НОднако эти способы на хлопчатнике дают неудовлетворительные результаты Известен также способ приготовления давленых препаратов для изучения метафазных хромосом хлопчатника, при котором хлопчатник намачивают,в касторовом масле 24 ч, затем тщательно промывают и помещают в термостат для проращивания. У проростков корешки фиксируют в смеси Лeвитcкqгo (I:1) промывают в проточной воде, обезвоживают спиртом, мацерируют в 20%-ном растворе едкого натра, выдерживают в ацето-железо-гематокислине при 40 С более 3ч, подогревают вместе с краси телем на спиртовке 3-4 мин, затем уда ляют корневой чехлик и получают 2-3 среза кончика корешка, которые укладывают на предметное стекло в каплю . проеветлякмцей смеси, накрьшают покровHbw стеклом, после чего кЛетки разгоняют легким нажимом ногтя в один слой и покровное стекло заклеивают густым канадским бальзамом. Просветляющую среду (смесь) готовят из 1/3 глицерина и 2/3 концентрированного водного раствора хлоралгидрата 21. Однако этот способ обладает рядом недостатков. Намачивание семян в касторовом масле отрицательно сказывается на их прорастании; материал (корешки) , как правило, давится неудовлетворительро, в результате чего клетки под покровным стеклом распластываются неравномерно, отчасти разрушаются, налегают друг на друга, хромосомы окрашиваются монотонно в темнофиолетовый, почти черный цвет, без четкого-выявления морфологических признаков и распологаются в метафазных пластинках скученно, не в одной плоскости; во многих случаях препара ты оказываются в значительной степени загрязненными капельками жира и жироподобных веществ. Приготовление более или менее удачного препарата п этому способу носит весьма случайный характер. Целью изобретения Является улучшения качества препаратов. Поставленная цель достигается тем что- в способ приготовления давленных препаратов хромосом хлопчатника, включающий фиксацию корешков по Левитскому, обработку раствором едкого натра, окрапгавание в ацето-железогематоксилине, включают следующие оп рации: корешки, зафиксированные по Левитскому (:), промытые и обезвоженные ДО 70%-ного этанола, обрабатывают непосредственно или после пос фиксации по Карнуа (6:3:1) 1 н. раст вором едкого натра, промывают дистил лированной водой 20-30 мин,окрашиваю в ацето-железо-гематоксилине при 29ЗЗ С в течение от 1,5 до 24 ч, отмывают от излишков красителя дистиллированной водой 20-30 мин, после чего кончики окрашенных корешков частично мацирируют с помощью цитазы, промывают дистиллированной водой и приготовляют давленые препараты с ис пользованием в качестве просветляющей среды, 45%-ной уксусной кислоты. Корешки обрабатывают 1 н. раствором едкого натра в течение 1-3 ч течение при температуре 25-30 С или 15-25 ми при 60 С. При частичной мацерации кончики окрашенных корешков выдерживают в цитазе в плотно закрытом сосуде в те чение 1,5-7,0 ч при 20-25 С или одних-трех суток при 3-7 С. Пример. Семена хлопчатника пяти видов проращивают в термостате в чашках Петри на увлажненной фильтровальной бумаге при температуре 29-30 С. По достижении корешками дли ны 6-15 мм лучшие из них отделяют от проростков и погружают в свежепри готовленную смесь Левитского, состоящую из равных частей 1%-ной хром вой кислоты и 4%-ного формальдегида. Фиксация корешков длится 24 ч. После фиксации корешки промывают в проточной воде 3ч, обезвоживают поочередно в 30-, 50- и 70%-ных растворах этанола по 10-15 мин. В 70%-ном этаноле до приготовления давленых препаратов корешки можно хранить несколько суток в холодильнике, что необязательно . Далее: 1) корешки дополнительно фиксируют (постфиксация) по Карнуа (6:3:1) в течение 20 ч; 2)промывают последовательно в 96и 70%-ных растворах этанола по 10 мин: 3)обрабатывают 1 н. раствором едкого натра при 60 С 20 мин; данную обработку рекомендуется проводить в небольшом объеме (4-5 мл) раствора щелочи в маленьком тонкостенном сосуде с пробкой в тер1мостате при в камере; вместо этого корешки можно обрабатывать 1 н. раствором едкого натра при 25-30 0 в течение 1-3 ч; 4)промывают в 5-6 сменах дистиллированной воды при комнатной температуре 25 мин; 5)слегка обсушивают фильтровальной бумагой, убрав влагу с их поверхности;б), выдерживают в свежефильтрованном через бумажный фильтр ацето-железо-гематоксилине при 29-30 С 20 ч; 7)отмывают от излишков красителя дистиллированной водой 30 мин; в это время удаляют ненужные части, оставляя кончики корешков длиной 1,21,5 мм; 8)помещают кончики корешков в каплю цитазы в маленьких плотно закрытых сосудах (фарфоровых тиглях, закрываемых корковой пробковой пробкой) при на 1,5-7,0 ч; 9)полощут в дистиллированной воде 3т5 мин; 10)расщепляют каждый корешок в воде, преимущественно вдоль, на тричетыре части; 11)полощут каждую часть корешка отдельно в 45%-ной уксусной кислоте, помещают в свежую каплю этой кислоты на предметном стекле, накрывают покровным стеклом, приготавливают давленый препарат. Ацето-железо-гематоксилин готовили по способу: 4 г гематоксилина растворяют в 100 мл 45%-ной уксусной кислоты в колбе, затем добавляют 1 г железо-аммонийных квасцов. Колбу закрывают неплотно ватной пробкой и оставляют в светлом теплом (26-30 С) месте на шесть-семь суток для созревания красителя. Содержимое колбы ежедневно несколько раз взбалтывают.При температуре ниже созревание может длиться более семи суток. Госле созревания краситель фильтруют через бумажный фильтр и хранят в холодильнике. Краситель сохраняет свои крася щие свойства более месяца. Перед употреблением краситель взбалтывают и фильтруют через бумажный фильтр. Приготовленные по предлагаемому способу давленые препараты имеют инте сивно окрашенные хромосомы с четко выраженными морфологическими признаками. Формула изобретения 1. Способ приготовления давленых препаратов хромосом хлопчатника, вкл чающий фиксацию корешков по Левитско му, обработку раствором едкого натра, окрашивание в ацето-железо-гематоксилине, отличающийся тем, что, с целью улучшения качества препаратов, корешки, зафиксированные по Левитскому (1:1), промытые и обез воженные до 70%-ного этанола, обрабатывают непосредственно или после постфиксации по Карнуа (6:3:1) 1 н. раствором едкого натра, промывают дистиллированной водой 20-30 мин, ок рашивают в ацето-железо-гематоксилине при 29-33 С в течение от 1,3 до 24 ч, отмывают от излишков красителя дистиллированной водой 20-30 мин, после Чего кончики окрашенных корешков частично мацерируют с помощью цитазы, промывают дистиллированной водой и приготовляют давленые препараты с использованием в качестве просветляющей среды 45%-ной уксусной кислоты. 2.Способ по п. , отличающий с я тем, что, корешки обрабатывают 1 н. раствором едкого натра в течение 1-3 ч при температуре 2530 С или 15-25 мин при бСРс. 3.Способ попп. 1и2, отличающийся тем, что, при частичной мацерации кончики окрашенных корешков вьщерживают в цитазе в плотно закрытом сосуде в течение 1,57,0 ч при 20-25°С-«ли одних-трех суток при 3-7°С. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М., Колос, 1974, с. П9-127, 176-181. 2. Цитология и генетика, т. 5, № 2, 1971, с. 184-185 (прототип).