Анионообменный материал для разделения биологических макромолекул и способ его получения Советский патент 1981 года по МПК B01J20/10 B01J19/04 

кремния анионного типа с удельной поверхностью 5-80 и средним диаметром пор 50-1000 ммк.

Кроме TOio, анионообменный материал в качестве полисахаридных полимеров содержит соединения с молекулярным весом Ю дальтон, имеющих общую формулу

R.

- (CHj) - N;

R

Ra

TJ j

где

остаток декстрана, крахмала, целлюлозы- или агароэы;

целое число от 1 до 70,

n предпочтительно от 2 до 5;

и HT одинаковые или различные радика/,ьт - СИ, CH.

- , -{сигЬ ОНили

-СИ -СНОИ -СНзОтличительным признаком способа получения анионообменного материала является пропитка макропористого водонерастворимого неорганического кисла 1-. водным ргхстворомпо-. исахарида при рН 3-12 и последующая суц1ка материалов при 4 О-120° С до постоянного веса.

Пористыми неорганическими носителями могут являться окиси алюминия, магния, титана или их сиЕ1тетические или природные производные, такие как стекла, силикаты, каолин и т.д.

Аминирован.ный полисахаридный полимер наносится на пористый неорганический носитель путем импрегнирования, причем механизм адгезии позволяет успешно наносить покрытия, на такие пористые нос15тели, как окись алюминия с неотрицательной поверхностью. Выбранные интервалы структурных характеристик пористого неорганичес-кого носителя являются оптимальными, так как в случае больших поверхностей или малых диаметров пор внутренняя поверхность носителя становится недоступной для аминированного полисахаридного полимера, а возможно, также, и для подлежащих разделению макромолекул. В зависимости от выбранного варианта.изобретения пористыйнеорганический носитель представляет собой двуокись кремния или окись алюминия и предпочтительно представляет собой пористую двуокись кремния анионного типа. Можно использовать также пористые двуокиси кремния, площадь noaepkHOCTH которых составляет соответственно 50, 25 и 10 MVr.

Аминированный полисахаридный полимер, который используют для импрегни-. рования, должен относиться к отчетливо анионному типу и иметь хорошие гидрофильные свойства.

Предпочтительным является использование диэтиламинодекстрана (ДЕАЕ) (соединение с молекулярным весом 500000) и четвертичного диэтиламино-,

декстрана (ОАЕ), а также соединения, известного под названием крахмал ДЕЛЕ (диэтиламинокрахмал).

Технология способа получения анионообменного материала состоит в следующем.

Пористую неорганическую окись в виде.сухого порошка вводят в хроматографическую колонку и проводят промывание и гомогенизацию для удаления пузырьков воздуха, пропуская для это цели кислый раствор, например 0,1 н. соляную кислоту. После этого пропускают через колонку буферный раствор с величиной рН 3-12 до достижения равновесного состояния.

Затем через колонку на -холоду или при нагревании пропускают аминированный полисахаридный полимер, растворенный в приведенном выше буферном растворе или в воде, величина рН которой установлена на том же уровне. После этого избытрк аминированного полисахаридного полимера удаляют путем промывкиуказанным выше буферным раствором, а затем раствором соли, например раствором тринатриевой соли лимонной кислоты; отсутствие в конечном элюате аминированного полисахаридного полимера может быть.установлено путем электрофореза на ацетилцеллюлозе и окрашивании пластин ки пунцовым красным или осаждением в присутствии полиакриловой кислоты.

Затем пропитанный материал в печи при температуре, находящейсВ в интервале между 50 и 120°С, предпочтительно при температуре , до достижения постоянного веса, гомогенизируют и просеивают для удаления возможных агломератов. Материал, полученный предлагаемым способом, используют в колонке после предварительного пропитывания при помощибуферного раствора или раствора 0,5 М по цитрату, рН 4 или 0,05 М по цитрату, рН 6,8; для обратимого поглощения биологических макромолекул, например белков, в количестве 40-200 мг белка на 1 г сорбента.

Предлагаемый способ позволяет получать материал, покрытие которого, состоящее из аминированного полисахаридного полимера, фиксируется практически необратимым образом.

Так, этот материал можно промывать 0,1 н. соляной кислотой г раствором гидрата окиси натрия или аммиака с.концентрацией 0,1 н. без ухудшения способности к обмену анионов. Если возникает необходимость в регенрации пористой неорганической окиси, то производят обработку материала в значительно более жестких условиях, например при помощи дымящей азотной кислоты.

пример 1. 10 г сферозила ХОСОО5 помещают в колонку.лля хроматрграфирования, насыпая, непосредственно, сухой и гомогенный порошок, что облегчает заполнение ко лонки. После этого в колонку при помощи перистальтического насоса вводят 100 мл О , 1 н. соляной кислоты со скоростью подачи 500 мл/ч для того, чтобы промыть, пропитать ко- лонку и вытеснить все пузырьки воздуха (предпочтительно ведут элюирование -в восходящем потоке) . Затем в колонку вводят буферный раствор с величиной рН 3-12 до достижения равн весного состояния, что контролируется измерением величины рН и удельным сопротивлением буферного раствора на выходе из колонки. После этого со скоростью 100 мл/ч вводят примерно 20 мл 1%-ного раствора декстрана (ДЕАЕ) в вышеуказанном буферном раст воре или в воде,, величину рН которой устанавливают на требуемом уровне. После этого избыток не фиксированног декстрана злюируют тем же буфернвш раствором, а затем 0,05 М раствором цитрата с величиной.рН 4 и 0,05 My раствором цитрата с величиной рН 8, которые пропускают со скоростью 1000 мл/ч. Отсутствие декстрана ДЕАЕ в конечном элюате определяют методом электрофореза,на ацетилцеллюлозе и по окрашиванию пластинки пунцовым красным или методом осаждения в присутствии полиакриловой кислоты. Пропитанный таким образом сорбент сушат в печи при 40-120С, предпочтительно при , в течение необходимого периода времени (например 15 ч) до дос тижения постоянного веса. Образовавшийся в результате сушки порошок гомогенизируют и просеивают, если это необходимо, для того,чтобы удалить возможные агломераты, а затем используют для изготовления колонки. После заполнения колонки и предварительного промывания буферными растворами 0,1 н. по НСВ или 0,05 М раствором цитрата с величиной рН 4, или 0,05 М раствором цитрата с величиной рН 6,8 или 0,1 н. раствором гидрата окиси колонку приводят в состояние равновесия при помощи того же типа буферного раствора, который применяется при хроматографии этого типа. Емкость колонки в от ношении фиксации белков составляет величину порядка 40-200 мг/г, в зави симости от условий хроматографирования. В этом примере декстран ДЕАЕ може быть заменен другим аминированным полимерным полисахаридом, таким как крахмал ДЕАЕ. Предложенный анионообменный матер ал применяют либо для избирательной фиксации биологических макромолекул, которые желательно выделить или очис тить, либо для избирательного задерживания примесей или других белков, присутствие которых является нежелательным. Избирательная фиксация белков легко может быть достигнута путем регулирования величины рН и полярности в соответствии с хорошо известными ме- . тодами, применяемыми в области использования ионного обмена. В том случае, когда материал фиксирует макромолекулы , которые желательно очистить или выделить, данные макромолекулы после этого элюируют раствором с подходящей величиной рН и полярностью. В том случае, если материал задерживает примеси, биологические макромолекулы собирают непосредственно в растворе. После этого производят злюирование раствором с подходящими величинами рН и полярности для удаленвя примесей и производят регенерацию материала для последующего его использования. Нижеследующие примеры подтверждают эффективность применения материала для очистки гамма-глобулинов из сыворотки людей или животных; удаления гемоглобулина при процессе очистки альбумина из плацентарной крови и концентрации других белков; концентрирования разбавленного раствора белков в спиртовой среде и удаления спирта; концентрирования и очистки альбумина в растворе каприлата натрия; концентрирования и очистки ганглиозидов из водных экстрактов мозга . животных. П р- и М ер 2 . Проводят прямую очистку гамма-глобулинов из сыворотки или плазмы людей и животных, используя 50 г сорбента, приготовленного в соответствии с примером 1 по следующей схеме: сначала приводят колонки в состояние равновесия с буферным раствором с величинойрН. 6,8, например между 6,3 и 8 (буферный фосфатный раствор 0,01-0,02 М) или буферный раствор трис-НСЕ, 0,05 или раствор хлористого натрия с концентрацией 1-3г/л со скоростью 200 мл-см /ч. Затем вводят 50 мл плазмы или сыворотки, предварительно диализованных против буферного раствора, применяемого при хроматографировании, и профильтрованных (средняя скорость подачи 50-100 мл «см V) . После этого промы ают колонки буферным растврром, применяемым при хроматографиррвании. Далее собирают фракцию выходного пика, состоящего из чистых гамма-глобулинов, чистоту которых проверяют иммуноэлектрофорезом, с выходом, находящимся в интервале между 50 и 100%, в зависимости от применяемых буферных растворов. Выход является более высо,ким при величинах рН ниже, чем 6,6 или при более высоких ионных силах, но при. этом воэникйет опасность, чт продукт будет недостаточно чистым. Такое получение гамма-глобулинов освобождает их от пирогенных вещест и от антигена, ассоциирующегося с гепатитом в (А НВ), которые могут присутствовать в сыром исходном мат риале . Затем элюируют другие белки, удер живаемые в колонке, каким-либо буферным раствором с величиной рН 4 ил буферным раствором, применяемым при хроматографировании, с добавкой 1060 г/л хлористого натрия, или же цитратным буферным раствором 0,05 М с рН 4-8, Продолжительность цикла составляет примерно 2 ч и при применении простой автоматики, в один и тот же день можно провести десяток циклов, т.ё. Выход при обработке будет близок к 10 л сыворотки или плазмы На 1 кг пористой неорганической окиси в день. Пример 3, Проводят удаление гемоглобина при очистке альбумина из плацентарной крови и концентрировани других белков. Исходный раствор готовят путем фракционирования плацентарной крови спиртом через стадию осаждения массы глобулинов при рН 6,8 в среде 20-25%-ного этанола. В этих условиях альбумин, некоторые альфа-1, альфа-2 глобулины и гемоглобин остаются в верхнем слое раствора. Их собирают путем центрифугирования на холоду, разбавляют равным объемом дистиллиро ванной воды для того, чтобы снизить концентрацию спирта, величину рН устанавливают на уровне между 6 и 7 и жидкость осветляют путем фильтрования через мембраны из сложных эфиров целлюлозы. Схема цикла очистки на 50 г сорб.е.нта. Приводят колонки в равновесное состояние при помощи буферного фосфа ного раствора 0,01 М или трис-НС2 0,05 М с величиной рН 6-7 (предпочтительно 6,5) при скорости подачи 200 мл-см ч. Вводят при средней скорости пода чи- 00-млlcмVч 1000 мл описанного выше и подлежащего очистке раствора Промывают колонки буферным раств ром, применяемым при хроматографии при той же скорости подачи. Очищенный гемоглобин удаляют из колонки при незначительной степени разбавления, в то время- как другие бёлки такие как альбумин, остаются фиксированными на колонке, Элюируют белки, фиксированные на колонке, в условиях идентичных прив денным в примере 2, причем пик содержит концентрированные белки, пра тически лишенные гемоглобина. Продолжительность этого цикла составляет 4 ч, после которого мож-, но сразу же начать новый. Пример 4, Проводят концен трирование раствора протеинов, разбавленных в спиртовой среде, и удаление спирта из 2% раствора альбумина, содержащего 10% этилового спирта, по следующей схеме (при использовании 1 кг сорбента). Сначала приводят колонки в состояние равновесия при помощи 0,01 М фосфатного буферного раствора с рН 7 скорость подачи 200 млcмVч, Затем вводят спиртовый раствор альбумина, величина рН которого установлена на уровне 7 путем пpибaв Ieния соляной кислоты или гидрата окиси натрия, в зависимости от начальной величины рН, ПРИ средней скорости подачи 100 . Таким способом на колонке фиксируют 200 г альбумина (либо 10 л раствора за цикл); если альбумин плохо фиксируется на колонке,следует разбавить исходный раствор дистиллированной водой для того/ чтобы снизить ионную силу среды. Затем колонку промывают дистиллированной водой со скоростью подачи 200 мл«см 7ч и проверяют полноту (удаления спирта. Далее элюируют альбумин одним из следующих буферных растворов: 0,1,. М раствором хлористого натрия или 0,05 М раствором цитрата с рН 6,8, ,при этом, как правило, конечная концентрация альбумина составляет 1020%, удаление спирта является полным, выход при таком методе .равняется примерно 100%. Этот способ применим для всех белков, нзоэлектрическая точка которых ниже,чем 6,5. В случае тех белков, изоэлектрическая точка которых превышает эту величину, метод применим при условии, что величина рН буферного раствора, используемого при хроматографировании, будет повышена. Все примеси, присутствующие в этих белковых растворах, также могут быть удалены при условии, что они являются электрически нейтральными (глюциды и полисахариды) или имеют положительный заряд того же типа что и сорбент, В случае примесей, имеющих отрицательный заряд, может произойти на сорбенте конкуренция с отрицательно заряженными белками, которые желательно фиксировать, В этом случае, если степень сродства примеси к сорбенту является меньшей, чем степень сродства белка, и если раствор может быть разбавлен в достаточной мере водой для достижения ионной силы, совместимой с фиксацией белков, на сорбенте можно произвести удаление таже катионов, Пример 5. Проводят рирование и очистку альбумина врас воре каприлата натрия из раствора, содержащего 15 г/л альбумина и 3 г/ каприлата. Схема цикла для 1 кг сорбента сл дующая . Колонки приводят в равновесное состояние с фосфатным буферным раст вором 0,01 М, рН б - скорость лодачи 200 . Вводят растворы альбумина и капр лата, величина рН которых установле на на уровне 6 (в случае чрезмерно высокой ионной силы проводят разбав ление водой) со средней скоростью подачи 100 млсм ч. Пропускают таким образом через колон1 у примерно 8 л раствора, непрерывно контролируя фиксацию альбумина и выход каприлата натрия. Затем промывают колонку буферным раствором, используемым при хромато графии до тех пор, пока не прекрати ся, выход каких-либо веществ из коло ки. Далее элюируют альбумин в соответ ствии с методом, изложенным в предшествующих примерах. При этом получают раствор, содержащий от 10 до 20% альбумина, который после того, как его концентрация будет доведена до 20%-ной, содержит меньше чем 2,5 г/л каприлата натрия. Общая продолжительность цикла составляет примерно 4 ч. Из этого примера видно, что метод может быть распространен на очистку и концентрирование различных биологических молекул, имеющих биологические заряды при определенных величинах рН, например нуклеиновых кислот, белков, анионных полисахаридов. Пример 6. Проводят концентрирование и очистку Iанглиозидов из водных экстрактов мозга животных. Ганглиозиды представляют собой гликолипиды и в настоящее время био химики изучают ту весьма важную роль которую они играют в физиологии и в патологии на уровне клеточных .перего родок в качестве рецепторов и аффекторов. Они содержат большее или мень шее количество сиалиновой кислотй и поэтому при величинах рН выше, чеМ йримерно 3, заряжены отрицательно. Из 1 кг бычьего мозга получают водный экстракт в количестве около 7л. Эти водные экстракты пропускают непосредственно через колонку, заполненную 50 г сорбента, приготовленного по способу, описанному в примере 1,.предвавительно приведенно му в равновесное состояние при помощи буферного раствора трис-НСЕ 0,05 м, рН 6,8. Скорость подачи составляет 200 млcмVч. Все ганглиозиды в этих условиях фиксируются. колонке. Затем проводят предварительную промывку следующими растворами в указанной последовательности: трис-Нсе 0,05 М, рН 6,8; 0,1-М раствором гидрата окиси натрия и водой. После этого проводят основную прогмывку хлороформом, метанолом и водой в соответствующих объемных отношениях (30:60:25), что позволяет удалитьмногочисленные примеси-. Далее элюируют ганглиозиды в концентрированной и очищенной ферме при той же скорости подачи, при помощи смеси: хлороформ-метанол - 0,1 н. соляная кислота в соответствующих объемных соотношениях (30:60:25). После элюирования собранный пик нейтрализуют путем прибавления 0,1 н. расггвора гидрата окиси натрия, выпаривают и растворяют в какой-либо хроматограф 1ческой системе для анализа. Выходсоставляет 100%. В данном разделении анионообменный материал, без какого-либе вреда для себя, может использоваться при многократном переходе от органического растворителя к- водному раствору и наоборот, что исключает необходимость стерилизации хроматографической колонки после каждого цикла. Предлагаемый материал можно применять также при очистке антител или антигенов. - В этом случае проводят пропитку пористого неорганического носителя согласно изобретению иммобилизированным антигеном или антителом и используют модифицированный таким образом материал для очистки и концентрирования соответствующих антител и антигенов. Так можно иммобилизировать альбумин, альфа-, бета- и гамма-глобулины лйдей или животных. Все бактериальные антигены и ядовитые антигены при величине рН 6,8 обладают отрицательными электрическими зарядами. имеет место для большинства белков,полисахаридов и известных кулеиновых кислот,таких как гриппозный рирус,вирусы бешенства, чумы,оспы, аденовирус и т.д. Также можно иммобилизировать различные энзимы, что ведет к образованию следующих материалов.с энзиматической активностью: пепсина, трипсина., хинотрипсина, плазмина, о(.-аминогадипазы и т.д. Наконец, предлагаемые материалы могут быть также использованы для иммобилизации йолекуд низкого молекулярного веса,таких- как молекулы некоторых аминокислот, или некоторых лигандов, содержащих аминогруппы спиртов или тиоспиртов, или диэпоксил ных соединений. Так, например, возможно иммобилиэировать лизин,и полученный материал может быть использован для очистки

или для удаления плазминогена или плазмина, белка крови, обладающего высокой степенью сродства по отношению к лизину.

Точно также можно иммобилизировать различные стероиды и использовать также материалы, уже модифицированные для очистки их белком переноса. Наконец, возможно иммобилизировать различные клеточные рецепторы, например ганглиозиды, предварительно дезацетелированные для деблокирования наиболее реакционно способных аминогрупп и для того, чтобы использовать эти материалы для удаления, нейтрализации, или очистки их лигандов.

Таким образом, предлагаеглый анионообменный материал может.найти само широкое применение в хроматографическом разделении различных биологических макромолекул.

Формула изобретения

1. Анионообменный материал для разделения биологических макромоле- 25 кул, содержащий минеральный носитель и водора.створимое полимерное вещество, отличающийся тем, что, с целью улучшения физико-механических свойств и повышения обменной jQ способности материала, в качестве носителя он содержит макропористый водoнepa.cтвopи Jый окисел, а в качестве водорастворимого полимерного вещества - полисахаридные полимеры при еле- s дующем соотношении компонентов, вес %:

Полисахаридные

полимеры2,0-20,00

Неорганический

окисел{Остальное

;;2,-Анионоо6менныйг материал по П.1, отличающийся тем, что в качестве макропористого водонерастворимого окисла он содержит двуокись кремния анионного типа с удельной поверхностью 5-80 и средним диаметром пор 50-1000 ммк.

3. Анионообменный материал по пп. 1и2, отличающийся тем, что в качестве полисахаридных полимеров он содержит соединения с молекулярным весом 10 - 10 дальтон, имекждих общуЮформулу

. R - (CH,.)r-N «а

R остаток декстрана, крахгдемала, циллюлозы или агорзы;.

целое число от 1 до. 10;

п

R/

и R одинаковые и различные радикалы - СН-з,, CHjCH, - CH,j,OH, -{СН-)20Н или CHa-cHOH-cHj.

4. Способ получения анионообг елного материала по п.1 заключающийся в том, что макропористый водонераствориглай неорганический окисел пропитывают 1-10%-ным водным раствором полисахарида при рН 3-12 и затем сушат при 40-120-с до постоянного веса.

Источники информации, Q принятые во внимание при экспертизе

1,Авторское свидетельство СССР № 467883, кл. С 01 В 33/14,1972.

2.Патент Великобритании 1043616, кл. С1А, 1964.