(54) СПОСОБ ОТДЕЛЕНИЯ ПРОТЕИНОВ
1
Изобретение относится к способу отделения протеинов посредством ионного обмена и может найти применение в биологии, фармацевтической и пищевой промышлениости при очистке сточных вод.
В пептидной химии широко используют очистку синтетических и выделенных из природного сьфья пептидов ионным обменом 1, (2 и 3.
В качестве ионообменникОв используют ДЕАЕ-Сефадекс А-50, СМ-Сефадекс С-50 и другие производные целлюлозы и декстрана.
Протеи вводят в колонку, заполненную набухшим носителем в водном или буферном растворе с различными значениями рН и ионной силы. В зависимости от стоящей задачи злюент и ионообменник могут быть подобраны таким образом, что или пептид, шш примеси сорбирукиг на колонке, а затем в случае сорбции пептида, последний вымывают, меняя ионную силу и рН элюёнта.
Недостатками нэвестных способов являются низкая механическая 1фочность ионообмеинико, их быстрое старение, уплотнение слоя при хроматографирований, что снижает скорость прохождения элюёнта и удшшяет процесс: изменение
ионообменника в зависимости от величины рН и ионной силы рабочей среды; способность их к биологическому разложению и отсутствие возможности их стерилизации, что исключает использование их при приготовлении фармацевтических препаратов.
Цель изобретения - упрощение процесса отделения проте1шов.
Это достигается способом отделения протеинов путем контактировашы протеинов в водном буфере с ионообменной смолой и последующего элюирования -протеинов буферным водным раствором щ)и изменении ионной силы и рН буфера, заключающимся в том, что в качестве ионообменной смолы используют пористый минеральный носитель с размером частиц от 5 мкм до 2 мм, удельной поверхностью от 5 до , .диаметром пор от 500 до 2500 А°, объемом пор от 0,4 до 2 мл/г, покрытый пленкой сшитого поперечными связями полимера плотностью от 1,05 до 8,9 мг/м, содержащего или несущего анионообменные грушш,представлешше формулам
(t-CH,-N-CH,- ИЛИ -CHj-N-(R3)X
R
где R.имеет одинаковые или различные значения и является алкилом или гщфоксиалкилом Cj -СлX - хлорнд., сульфат, нитрат, фосфат или цит1)ат, либо катконообмешгые группы, например, карбоксильную или сульфогруплу с ионообменной способносЬю от 0,3 до 1,95 мэкв/г.
Предпочтительно использование в качестве минерального носителя окиси алюминия или двуокиси крем1шя и в качестве сшитого поперечными связями полимера - продукта полимеризации эпоксидных соединений и полиаминов; смеси виниловых мономеров; стирола и его производных акриловой кислоты, метакриловой кислоты с полифункциональными мономерами (диакрилат или диметакрилат моно- или полиалкилеетликоля, ви нилтриалкоксисилана или винилтригалогенсютана)
Преимуществом способа являете я ускорение процесса, так, например, при очистке альбумина и при выделении |р-глобулина из сыворотки крови скорость процесса составляет 180 и ЮОют/час cooTBeTCTBefrao.
Кроме того, увелшпшается срок службы смолы. После 10 последовахелыю проведенных операций никаких признаков старения смолы не было обнаружено.
Предлагаемый способ позволяет отделять протеины от их растворов, таких как молочная сыворотка (лактссерум), пиво, кровь, органические экстракты и все промышленные стоки; от остаточных продуктов скотобойни, пищевого производства, крахмального производства являясь, так11м образом, средством очистки укааанш 1Х сточных продуктов.
Отделение протеинов достигается в результате контактирования обрабатываемого раствора при телшературе, и таких значений ионной силы и рН, которые обеспечивают совместимость npOTeiffiOB с ионообменной смолой, Бь«бор которой определяется условиями отделения протеинов. Таким образом, на ионообмеш1ой смоле происходит фиксация либо требуемого протеина, либо других протеинов, содержащихся в растворе, либо всех протеинов раствора.
В случае, когда нужно получить несколько протеинов, ИХ отделение и концентрирование может быть достигнуто контактироватшем о6.рабатываемого раствора последовательно с несколькими катионообмешп 1ми смолами или с несколькими катионо- и анионообменными смолами. Таким образом, возможна выборочная фиксация протеинов из раствора на каждой смоле.
В случае, если требуемый протеин фиксируется на смоле из протеинового раствора, то затем его отделяют элюированием раствором, имеющим величину рН и ионную силу, отличные от величшш рН и ионной силы фиксируемого раствора, но совместимые с протеином.
Таким образом, достигается не только отделение протеина от раствора, но и его очистка и концентрирование. Так, например, можно отделять и концентрировать альбумин, пепсин, протеины лактосерума посредством анионообменной смолы и лизоцим посредством катионообменной смолы.
Если же необходимо, чтобы требуемый протеин остался в протеиноволт;: растворе, то при этом фиксируют другие протеины смеси,происходит отделение требуемого протеина от других протеинов и, таким образом, обеспечивается его очистка. Элюирование фиксированных протеинов приводит к избирательному или неизбирательному отделению протеинов и их концентривагшю.Аналогично происходит отделение | -глобулина посредством анионообменной смолы.
В случае, когда несколько требуемых протеинов фиксируется на смоле одновременно, то Элюирование раствором с величиной рН и ионной силой отличными от величины рН и ионной силы фиксируемого раствора приводит к разделению протеинов и их концентрированию. Элюирование растворами с повышенными значениями рН и ионной силы приводит кроме избирательного отделения протеинов к их очистке и концентрированию. В данном случае зтр относится, главным образом, к сыворотке.
Если есть необходимость удалить протеины, они фиксируются на смоле из их раствора. Таким образом получают очище1шые от протеинов растворы. Элюировайие фиксированных протеиFiOB позволяет повторно использовать смолу. В частности, это относится к осветлению пива и обработке растворов, содержащих гемоглобин, посредством катионообменных смол.
Отделение протеинов можно осуществлять с идентичными результатами как прерывным, так и непрерывным способом.
Получен1а1е результаты 1фактически не зависят от концетграции обрабатываемого раствора, но зависят от типа иoнoc бмe шoй группы смолы, величины рН, ионной силы и расхода как обрабатываемого раствора, так и раствора элюирования.
Пример 1. Получение ионообменной смолы.
100 г двуокиси кремши с размером частиц от 100 до 200 мкм, удельной поверхностью 24 , средним диаметром пор 1400 А и объемом пор 1 мл/г сушат при 150°С при пониженном давлении пять часов. Полученную высуше11ную двуокись кремния вводят в раствор, содержащий 250 мл хлористого метилена, 60 мл ,перегнашгого стирола, 20 мл винилтриэтоксисилана и 0,5 г азобис-изобутиронитрила. Хлористый метилен испаряют при температуре окружающей среды и пропитанную двуокись кремния нагревают при 120° С шесть часов при дав лении 3 бара. .Из приготовленной двуокиси кре,л1я получают суспензию в 300 мл ксилола, нагревают ее при температуре кипения два часа. После фильтрации двуокись кремния промывают в ацетоне а затем высушивают. 50 г полученной двуокиси кремния суспензируют в-180 г хлорметилового эфира, содержащего 6 г четыреххлористого олова, затем смесь нагревают с обратным холодильником в тетение четырех часов в безводной среде. Посл охлаждения двуокись кремния отжимают, промывают 200 мл смеси диоксан/вода (50:50), содержащей 10 мл соляной кислоты, а затем водой до нейтральной реакции и сушат. Содержание углерода составляет 4,1%, хлора - 1,90%. Полученный 1фодукт суспензируют в 150 мл водного раствора, содержащего 30% триметиламина, и выд)живают 8 дней при комнатной температуре. Отымают, промывают, получают ионообменную смолу, несущую функциональные группы: CH -N СНзС1 . I которая имеет следующие характернстнкн: содержание углерода 4,8%; содержание хлора 2%; содержание азота 0,9%; количество осажденного полимера 3,3 ионообменная способность 0,5 мэкв/г. Обработка раствора альбумина. 10 г полученной ионообменной смолы вводят в колонку диаметром 1 см и оставляют под давлением, после чего 0,01 М буферным раствором фосфата рН смолы доводят до 6,5. Раствор альбумина с концентрацией 1 вес.% в том же буферном растворе вводят со скоростью 180 мл/час до насыщения колонки, что соответствует примерно 200 мл раствора. Затем смолу промывают 100 мл буферного раствора. Фиксированный альбумин элюируют путем перк яяции раствора ШМаСб в том же буферном ра створе, расход которого составляет 180 мл/час, 45 мл раствора обеспечивает извлечение альбумина с концентрацией 3,3 вес.%. Таким образом, смола имеет ионообменную способность с альбумином порядка 150 мг/г, что позволяет концентрировать раствор альбумина. После тридцати последовательных операций н обнаружено никаких признаков старения ионооб менной смолы. Пример 2. Аналогично примеру 1, используя раствор альбумина с конц гнтрацией 0,2 вес получали такие же хорошие результаты. Пример 3. Аналогично примеру 1, но злюирование протеина проводят 0,05 М буферным раствором цитрата (рН 6,5). Получают 59 мл раствора альбумина концентрацией 2,5 вес.%. Пример 4. .Обработку раствора альбумина проводят аналогично примеру 1, но используя . 41 г ионообменной смолы в колонке диаметром 1 см и при расходе элюента 80 мл/час. Получают раствор альбумина с концентрацией 7 вес.%. Установлено, что увеличение высоты колонки и уменьшение скорости злюирования приводит к увеличению концентрации получаемого раствора. Пример 5. Получение ионообменной смолы. В 150 мл хлористого метилена, содержащегося 6,5 г N, М-быс-(эпокси-2, 3-пpoпнл)-зтилaминa и 3 г тризтилентетраамкна, вводят 50 г двуокиси кремния с размером частиц от 40 до 100 мкм, удельной поверхностью 37 , днаметром пор 1100 А н объемом пор 1,05 мл/t. Хлористый метилен испаряют при температуре окружающей среды; пропитанную двуокись кремния нагревают при 60° С 60 ч, и промывают кипящей водой, а затем ацетоном. Получают смолу, состоящую из двуокиси кремния, покрытую сшитым полимером, содержащую функциональные группы; -СН -Ы-СНз, С-зНз которая имеет следующие характеристики: содержание углерода 8,8%; содержание азота 2,4%; количество осажденного полимера 3,3 мг/м; ионообменная способность 1. мэкв/г. Отделение I -глобулина. 10 г полученной ионообменной смолы вводят в колонку диаметром 1 см и оставляют под давлением. Смолу подкисляют 1 н. раствором соляной кислоты, затем добавляют 0,02 М буферный раствор фосфата, доводят величину рН до 6,5. Осуществляют )ованне 20 мл лишенного лилидов и яиофилизованного 1 вес.%-ного раствора сыворотки. В том же буферном растворе фосфата. Расход раствсфа 100 мл/час. Смолу промывают 50 мп того же буферного раствора фосфата. Раствор, выходящий из колонки, содержит чистый у -глобушш. Д зугие протеины, а именно о-глобулины, /3глобулины и альбумин, которые присутствуют в исходном растворе, фиксируются на смоле. Их извлекают элюнрованием ЗМ раствором NaCE в том же буферном фосфатном растворе. Если проводить злюирование буферным раствором повышенной ионной силы, то с увеличением концентрации NaCE получают растворы, обогащенные о(-глобу71инами, глобулинами и альбумином. Пример 6. Получение ионообменной смолы Аналогично примеру 5, но используя двуокись кремния с размером частиц от 100 до 200 мкм и 6,5 г М,М-бмс-(эпокси-2,3-прогаш)-бутиламина. Получают ионообменную смолу, состоящзто КЗ двуокиси кремния, покрытой сшитым полимером, содержащую функциональные группы -CHi-N-CHj которая имеет следз ющие характеристики: содержание углерода 9,2%; содержание азота 2,5%; количество осажденного полимера 3,2 ионообменная способность 1,1 мзкв/г. Экстракция протеинов. 10 г полученной ионообменной смолы вводят в колонку диаметром 1 см и оставляют под давлением. Смолу подкисляют 0,1 н. раствором соляной кислоты, а затем 0,01 М буферным раствором фосфата до рН 7,5. Проводят перколящио в том же буферном растворе фосфата 30 мл 1 вес.%-ного раствора ультрафилырованного лактосер5а 1а, содержащего 75 вес.% протеинов, при расходе раствора 80 мл/час. Смолу промывают 100 мм того же буферного раствора фосфата.. Раствор, выходящий из колонки, содержит жировые продукты и лактозу, присутствую1цую Б исходном растворе. Протеины, лактоальбумины, лактоглобулины, сывороточный альбумин (серумальбумин) и не значительная часть. иммуноглобулинов, присутствующих в исходном растворе, фиксируют на смоле. Путем элюирования буферным раствором Мак Ильваина (0,05 М, рН 4) извлекают отделенные и очищенные протеины. Пример 7. Экстракция протеинов. 20 г ионообменной смолы, аналогичной примеру 1, но с размером частиц от 200 до 500 мкм, вводят в колонку диаметром 2,5 см и оставля ют под давлением. Смолу подкисляют 0,1 н раствором соляной кислоты, затем 0,01 М буферным раствором нее до рн 7. Осуществляют перколяцию 600 мл полученного раствора, состоящего из 300 мл буферного раствора HCI и 300 мл лактосерутла, не содqpжaщeгo лшшдов, с концентрацией растворимых протеинов 0,5%, при расходе раствора 300 мл/час. Затем смолу промывают 100 мл буферного раствора. Раствор, выходящий из колонки, содержит лактозу, присутствующую в исходном растворе Проте1шы: лактоальбумины, лактоглобулины серумальбумин и незначительная часть иммуноглобулинов, присутствующие в исходном растворе, фиксируют на смоле. Их элюируют проп канием через колонку буферного раствора ,1 М цитратгидрата окиси натрия (рН 7). Поученный раствор содержит все фиксированные ротеины концентращ1ей 4 вес.%. Такая операция обеспечивает получение смеи чистых протеинов, не содержащих лактозу, более концентрированном растворе, чем исодный раствор. После тридцати последовательных операций е обнаружено никаких признаков старения онообменной смолы. Пример 8. Обработка раствора пепсина. 3 г ионообменной смолы, как в примере 1, водят в колонку диаметром 1 см. Смолу промывают 100 мл дистиллированной воды, затем перколируют 150 мл раствора сырого пепсина, содержащего 20 ед. пепсина/мл при расходе раствора 100 мл/час. Смолу промывают 20 мл дистиллированной воды. Раствор, выходящий из колонки, и водные промывки не проявляют активности; весь пепсин фиксируют на смоле. Загрязнения остаются в растворе. Фиксированный пепсин элюируют перколяцией 1 М раствором NaCE. Расход раствора 100 мл/час, 16 мл зтого раствора обеспечивает извлечение 170 ед. пепсина/мл раствора. Установлена высокая концентрация полученного раствора. После промывки 50 мл дистиллированной воды смола может быть использована повторно. После десяти последовательных операций не обнаружено никаких признаков старения ионообменной смолы. Пример 9. Получение ионообменной смолы. 100 г двуокиси кремния с размером частиц от 100 до 200 мкм, удельной поверхностью 25 , q)eдний диаметр пор 1400 А и объем пор 1,1 мл/г, пропитывают раствором 200 мл хлористого метилена, содержащего 24 г акриловой кислоты, 6 г диметакрилата дизтиленгликоля и 0,4 г перекиси бензоила. Хлористый метилен испаряют при температуре окражующей среды и атмосферном давлении до постоянного веса; затем пропитанную двуокись кремния нагревают при 80° С в течение 6 ч. Суспензию двуокиси кремния в 300 мл воды кипятят шесть часов. Отфильтровывают, промывают в ацетоне, сущат в вакууме при 80° С. Получают ионообменную смолу, несущую функционалып.1е группы СООП, которая имеет следующие характеристики: содержание углерода 10,55%; количество осажденного полимера 7,2 ионообменная способность 1,05 мэкв/г. Обработка раствора лизоцима. 10 г получешюй ионообменной смолы вводят в колонку диаметром 1 см и оставляют
под давлением, после чего смолу переводят в НН4-форму проводят перколяцию двух литров водного 0,5 М раствора ацетата аммония при рЙ 8,2. Величину рН смолы доводят до 6,5 добавлением 100 мл 0,02 М буферного раствора трис-малешювой кислоты.
Перколяцию раствора лизоцима концентрацией 1 вес.% проводят в том же буферном растворе при расходе 180 мл/час, до насыщения коловки, что соответствует примерно 200 мл рас вора. Затем смолу промывают 100 мл 0,02 М буферного раствора трис-малеиновой кислоты с величиной рН 8,2. Фиксированный лизоцим элюирзтот перколяцией 1 М раствором NaCI в том же буферном растворе, со скоростью 180 мл/час, 50 мл раствора обеспечивает извлечение лизоцима. Полу чают раствор лизоцима с концентрацией 2,5 вес Показано, что смола имеет ионообменную способность в отношении лизоцима 125 мг/г, что позволяет концентрировать раствор лизоцима. Пример 10. Получение ионообменной смолы. 100 г двуокиси кремния с размером частиц от 100 до 200 мкм, удельной поверхностью 37 , средний диаметр пор 1200 А и объем пор 0,95 мл/г, пропитывают раствором 150 мл хлористого метилена, содержащим 60 мл стирола, 20 мл винилтризтоксисилана и 0,5 г азобис изобутиронитрила. Хлористый метилен испаряют при температуре окружающей среды при атмосферном давлении до достижения постоянного веса, после чего пропитанную двуокись кремния нагревают при 120° С в течение щести часов. Суспензцию двуокиси кремния в 300 мл кси лола нагревают при температуре кипения в течение щести часов. Двуокись кремния отфильтр вывают и промывают в ацетоне, сущат при 80С 50 г модифицированной двуокиси кремния суспензируют в 500 мл хлороформа к суспензии по каплям добавляют раствор 50 г HSOjCt в 50 мл хлороформа. Смесь перемешивают при 50° С четыре часа, фильтруют, двуокись кремния пром 1вают водой до нейтрального состояния, ацетоном и сушат в вакууме при 80° С. Получают ионообменную смолу, несущую функциональные группы - ЗОэН, которая имеет следующие характеристики: содержание углерода 4%; содержание серы 1,4%, количество осажденного полимера 2,8 ионообменная способность 0,43 мэкв/г. Экстракция гемоглобина. 10 г полученной ионообменной смолы вводят в колонку диаметром 1 см, величину рН смолы доводят до 6,5 0,02 М буферным раство ром фосфата.
Осуществляют перколяцию 500 мл раствора гемоглобина концентрацией 0,2 вес.% в том же буферном растворе, скорость пропускания раствора через колонку 100 мл/час. Гемоглобин адсорбируется на ионообменной смоле. Выходящий из колонки бесцветный раствор не содержит гемоглобина.
Адсорбированный гемоглобин элюируют перколяцией 0,5 М раствором карбоната аммония. затем колонку промывают сначала 300 мл 0,1 н. гидрата окиси натрия, затем 50 мл I н. HCI. Пример 11. Приготовление анионообменпой смолы. 100 г двуокиси кремния с размером частиц от 100 до 200 мк, удельной поверхностью 24 , средний диаметр пор 1400 А и объем пор 1 мл/г, сушат 5 ч при 150° С и при пониженном давлении. . Сухую .двуокись кремния диспергируют в растворе, содержащем 250 мл хлористого метилена, 60 мл перегнанного стирола, 20 мл винилтризтоксисилана и 0,5 г азобисизобутиронитрила. Хлористый метилен испаряют при комнатной температуре, а пропитанную двуокись кремния 6 ч выдерживают при 120° С и давлении 3 бара. Суспензию двуокиси кремния в 300 мл ксилола выдерживают 2 ч при температуре кипения. Двуокись кремния отфильтровывают и промывают ацетоном, сушат. Показано, что содержание углерода составляет 4 вес.% по отношению к покрытой двуокиси кремния. 50 г полученной двуоьсиси кремния суспен- дируют в смеси 180 г хлорметилового эфира и 6 г хлорного олова, затем смесь нагревают 4 ч с обратным холодильником. После охлаждения двуокись кремния отжимают, промывают 200 мл смеси равных количество диоксана и воды, содержащей 10 мл хлористоводородаой кислоты, затем водой до нейтрального значения рН, и, наконец, сущат. Содержание углерода составляет 4,1%, хлора - 1,90%. Полученное вещество превращают в суспензию в 150 мл 30%-ного водного раствора триметиламина и выстаивают 8 дней при комнатной температуре. Фильтруют, промывают и получают ионообменную смолу, несущую функциональные группы: It+J(-) CHg-N-CHjCl которая имеет следующие характеристики: соержание углерода 4,8%; содержание хлора 2% содержание азота 0,9%; количество зафиксированного полимера 3,3 ионообменная способность 0,5 мэкв/г. Обработка молочной сыворотки. 20 г анионообменной смолы помещают в колонку диаметром 2.5 см (колонка 1). 10 г смолы, полученной в примере 9 помеща ют в колонку с диаметром 2,5 см (колонка 2) Две колонки устанавливают посчедовательно, смолу промывают 500 мл воды. 500 мл Молочной сыворотки подщелачивают до рН 7,5 0,1 н. NaOH, фильтруют для удалени нерастворимых примесей и перколируют в колонке 1 и затем в колонке 2 со скоростью 300 мл/час. После осаждения протеинов трихпоруксусной кислотой, показано, что выходящая из колонки 2 молочная сыворотка не содержит протеина. Смолу в обоих колонках промывают 100 мл воды. Проте1шы: лакталбумины, лактоглобулины, серумальбумин и очень небольшая часть иммуноглобулинов, присутствуюидае в составе, фиксируются на смоле в колонке 1. Их элюируют как описано в примере 7. , Протеины, зафиксирова1шые на смоле в колонке 2 являются, главным образом, незафиксированными на смоле из колонки 1 иммуноглобулинами. Их элюируют п жоляцией 1 М раствора карбоната аммония. Концентраиля иммуноглобулинов в полученном растворе составляет около 3 вес.%. Иммуноглобулины составляют около 16 вес.% всех протеинов, содержащихся в исходном растворе. Перед повтортадм использованием колонки промывают 500 мл воды. После десяти последовательных операций не обнаружено никаких признаков старения ионообменной смолы. Пример 12. Извлечение протеинов из пива. 60 г ионообменной смолы, получе1шой в пр мере 9, помещают в колонку диаметром 2,5 см н промывают 250 мл воды. 3 л неосветленного пива перколируют со ск ростью 100 мл/тас. Выходящее из колонки пиво не дает осадка при добавлении пикриновой кислоты и имеет характеристики осветвле1шого пива. Зафиксированные на смоле вещества являют ся, главным образом, протеинами. Их злюируют перколяциеа 400 мл 0,1 н. хлористоводоро ной кислоты. Перед повторньш использованием смолу про мьгаают 250 мл вода Пример 13. Получение ионообменной смо лы. 100 г двуокиси кремния с размером частиц т 0,5 до 2 мм, удельной поверхностью 5 , редним диаметром пор 2500 А, объемом пор ,4 мл/г, сушат при 150°С, при пониженном авлении 5 ч. Полученную сухую двуокись кремкремния вводят в раствор из 250 мл хлористого метилена, 60 мл стирола, 20 мл винилтрихлорсилана и 0,5 г азобис-изобутиронитрила. Хлористый метилен выпаривают при комнатной температуре, затем пропитаиную двуокись кремккя нагревают при 120° С 6 ч и давлении Збар. Двуокись кремния суспендируют в 300 мл ксилола и кипятят 2 ч. После фильтрования двуокись кремния промывают ацетоном, сушат. Содержание углерода составляет 3,2 вес.% по отношению к покрытой двуокиси кремния. 50 г полученной двуокиси кремния суспендируют в 180 г хлорметилового эфира, содержащего 6 г хлорного олова, затем смесь кипятят с обратш 1м холодильником 4 ч в безводной среде. После охлаждения двуокись кремния обезвоживают, промывают 200 мл смеси диоксана и воды (50:50), содержащей 10 мл соляной кислоты, затем водой до нейтральной реакции и, наконец, сушат. Содержание углерода составляет 3,8% и количество хлора 1,80%. : Полученный продукт суспендируют в 150 мл 30%-ного водного раствора трибутштамина и выдерживают 8 дней при комнатной температуре, После обезвоживагшя полученной получают ионообменную смолу несушзоо функциональные группы: -f)(-) Cl -N-Cj;iH9Cl которая имеет следующие характеристики: содержание углерода 4,7%; содержание хлора 1,8%; содержание азота 0,5%; содержание фиксированного полимера 3,3 ионообменная способность 0,3 мэкв/г. Обработка раствора альбумина. 10 г полученной ионообменной смолы помещают в колонку диаметром 1 см и оставляют под давлением и 0,01 М буферным раствором фосфата рН среды доводят до 6,5. Раствор альбумина с концентрацией 1 вес.% в 0,01 М буферном растворе фосфата (рН 6,5) пропускают через колонку со скоростью 180 мл/час до насыщения, что соответствует приблизительно 200 мл раствора. Затем смолу промывают 100 мл этого же буферного раствора. Фиксированный альбумин извлекают, элюируют 1 М раствором NaCE в этом же буфере со скоростью 180 мл/час. 50 мл раствора представляют собой раствор альбумина с концентра цией 1,8 вес.%. Показано, что ионообмеиник имеет объем альбумина 90 мг/г, он позволяет концентрировать раствор альбумина. После 30 последовательных операций не обнаружено ник ких признаков старения ионообменной смолы. Пример 14. Получение ионообменной смо лы. 100 г двуокиси кремния с размером частиц от 100 до 200 мкм, удельной повер остью 50 , средний диаметр пор 650 А и объемо пор 1,05 мл/г, пропитывают раствором из 200 мл хлористого метилена, 34 г акриловой кислоты, 6 г димётакрилата диэтиленгликоля и 0,4 г перекиси бензоила. Хлористый метилен выпаривают при комнатной температуре и атмосферном давлении до постоянного веса; пропитанную двуокись крем ния нагревают до 80° С 6 ч. Затем двуокись кремния суспендируют в 300 мл воды и кипятят 6 ч, отфильтровывают, промывают ацетоном и сушат в вакууме при 80°С. Получают ионообменную смолу, несущую функциональные группы - СООН, которая име ет следующие характеристики: содержание угле рода 13,2%; содержание фиксированного полимера 9,8 обменная способность 1,95 мэкв/ Обработка раствора лизоцима. 10 г полученной обменной смолы помещают в ,колонку диаметром 1 см и оставляют под давлением, затем смолу переводят в форму NN4, пропуская через нее 2 л 0,5 М раствора ацетата аммония до рН 8,2. Затем рН смолы доводят до 6,5 при помо1ЦИ 100 мл буферного раствора 0,02 М трнмалеиновой кислоты. Раствор лизоцима с концентрацией 1 вес.% фильтрзтот в этом же буферном растворе со скоростью 180 мл/час, до насыщения колонки, что соответствует приблизительно 200 мл раствора. Смолу промывают 100 мл 0,02 М буферного раствора трималеиноаой кислоты до рН 8,2. Фиксированный лизоцим злюирзтот 1 М раствором NaCE в таком же буфере, скорость пропускания раствора 180 мл/час. 50 мл раство ра позволяют рекуперировать лизоцим и получать раствор лизоцима с концентрацией 2,8 вес.% Показано, что обменник имеет объем лизоци ма 140 мг/г и что он позволяет концентрировать раствор лизоцнма. Пример 15. Получение ионообменной смолы. 100 г Окиси алюминия с размером частиц от 5 до 50 мкм, удельной поверхностью 150 м/г,средним диаметром пор 500 А и объем пор0,9 мл/г сушат при 150° С при пониженном давлении Полученную сухую смесь алюминия вводят в раствор из 250 мл хлористого метилена, 60 мл перегнанного стирола, 20 мл винилтриэтоксисилана и 0,5. г азобисизобутиронитрила. Хлористый метилен выпаривают при комнатной температуре, затем пропитанную окись алюминия нагревают до 120° С 6 ч, при давлении 3 бар. Затем окись алюминия суспендируют в 300 мл ксилола и суспензию кипятят 2 ч. Фильтруют, окись алюминия промывают ацетоном, сушат. 50 г Полученной окиси алюминия суспендируют в 180 г хлорметилового зфира, содержащего 6г хлорного олова, затем смесь кипятят обратным холодильником 4 ч в безводной среде. После охлаждения окись алюминия отфильтровывают, промывают 200 мл смеси диоксан вода (50:50), содержащей 10 мл соляной киСа лоты, затем водой до нейтральной реакции и сушат. Полученный продукт суспендируют в 150 мл 30%-ного раствора триметиламина и выстаивают 8 дней при комнатной температуре. После обезвоживания и промывки получают ионообменную смолу, несущую функциональные группы: 11+)(-) CHz-N-CHjCl , которая имеет следук-щие характеристики; содержание углерода 8,2%; содержание хлора 3,7%; содержание азота 1,5%; содержание фиксированного полимера 1,05 обменная способность 1,1 мэкв/г. ббработка раствора альбумина. 10 г полученной обменной смолы помещают в колонку диаметром 1 см и оставляют под давлением, затем 0,01 М буферным раствором фосфата доводят рН среды до 6,5. Раствор альбумина с концентрацией 1 вес.% фильтруют в зтом же буферном растворе, со скоростью 60 мл/час, до насыщегам колонки, что соответствует приблизительно 140 мл раствора. Затем смолу промывают 100 мл такого же буферного раствора. Фиксированный альбумин извлекают элюированием 0,1 н. раствором HCI со скоростью 0 мл/час; 25 мл раствора позволяют рекупеировать альбумин с концентрацией 45 вес.%. : Показано, что обмешшк имеет объем альумина 100 мг/г и Что он позволяет конценрировать раствор альбумина. Пример 16. Аналогично примеру 15, из 00 г окиси алюминия, с размером частиц
