Способ получения альбумина и гемоглобина Советский патент 1990 года по МПК A61K38/00 A61K38/01 A61K38/38 A61K38/39 

Изобретение относится к медицине и касается способа получения основных протеинов плацентарной гемоли- зированной крови, а именно альбумина и гемоглобина.

Целью изобретения является повышение производительности процесса.

П -р и м е р 1. 1. Этап осветления гемолизированной плацентарной крови. 150 кг целовеческой плаценты дробят в замороженном виде и диспергируют в 150 л воды, к которой добавляют 22 л этанола при температуре 0°С до конечной концентрации 8%. Полученную таким образом суспензию энергично перемешивают, затем подвергают фильтрации на прессе объемом 400 л, оборудованном металлической сеткой с пористостью 50 мкм, для отделения

кровяного сока .от плацентарньпс тканей. Полученная жидкость занимает обьем, равный 270 л. К ней добавляют либо уксусную кислоту, либо соляную кислоту нормальной концентрации (выбор кислоты не имеет значения) для доведения рП до-5,1 при перемешивании и температуре .

Через 2 ч суспензию вводят со скоростью 300 л/ч в центрифугу, удаляют осадок в количестве 7-10 кг (в разные дни по разному). Полученная в отстое кровь абсолютно прозрачна и занимает обьем приблизительно 260 л.

2. Стадия концентрации и диафильт- рации осветленной крови.

Используют ультрафильтр с мембраной, имеющей порог поглощения, равсл

со

00

ы

fO

ный 10 000 Дал. Для этой опефации хорошо подходят, например, два спиральных фильтрующих элемента по 5 м i каждый фирмы Миллипор. После концент- рации до примерно 60 л рН устанавливают равным 5,5 с. помощью нормального раствора едкого натрия,, а диафильтруют при постоянном объеме с помощью примерно 200 л умягченной воды,.Скорость удаления ультрафильтрата равна примерно 50 л/ч при давлении на входе, равном 4 бар. Вся операция продолжается примерно 8 ч при . Конечное значение рН близко к 5,25 и не изменяется. После регенерации ультрафильтр может использоваться без засорения еще 200 раз. После отстаивания в. течение 15 ч при 4с, концентрированная кровь со- 20

На одной колонке бьто осуществле- , но более 50 циклов без потери эффек I ТИВНОСТИ.

4. Конечное разделение гамма-глобулинов и гемоглобина,

Устаиавликают концентрацию хлорида натрия в предыдущем фильтрате (135 л),. равную 8 г/л, рН 7,О и фильтрат ох- ла кдают до . Затем постепенно добавляют 45 л ох11а 1оденного до -20°С этанола при перемешивании и в конце добавления устанавливают окончательную температуру, равную , После 15 ночи полученную суспензию центрифугируют со скоростью 300 л/ч. Полученный осадок гамма-глобулинов весит в среднем 900 г (данные по нескольким партиям) и затем его следует подвергнуть другим операциям очистки, которые известны, для получения иммуноглобулинов, пригодных для использования в медицине.

Падосадочный слой полностью прозрачен. Он содержит практически избавленный от иммуноглобулинов гемоглобин. Его разводят 300 л воды при температуре 0°С для того, чтобы снизить концентрацию ниже 10%. Этот раствор

25

держит легкий осадок эуглобулинов, который удаляют центрифугированием. Полученный осадок имеет вес 100 - 300 г в зависимости от партии. Концентрированную осветленную кровь в объеме 120 л фильтруют на мембране с пористостью 0,2 ммк и сохраняют в условиях стерильности до следующей стадии.

3. Стадия хроматографического концентрируют посредством ультрафильт- деления. Колонну диаметром 16 см и рации по описанной системе, он может высотой 1 м заполняют 9 кг Spheroбыть в конце подвергнут диафильтра- ции для регулирования ионной силы и состава раствора в соответствии с его будущим использованием. Количество полученного таким образом гемоглоdex-EE, уравновешанном в фосфатном буфере, 0,01 11,-рН 5,25 в стерильных условиях. Отфильтрованные и кон- центр фованные 120 л крови, которые были получены на предьщущей стадии,

вводят в колонну со скоростью 40 Л/Ч-.

Колонку промывают затем 40 п буфера РО , 0,01 М, рН 5,25, Фильтрат в объеме 135 л содержащий гемоглобин и иммуноглобулины, полностью лишен альбумина. Он сохраняется при тем- пературе 2 С до следующей стадии. Зафиксированный на колонке альбумин вместе с другими протеинами затем элюируют посредством введения 60 л раствора NaCl с концентрацией 20 г/л, Объема в 50 л достаточно для количественного извлечения альбумина, т.е. примерно 1200 г (в среднем 8 г/кг плаценты). Этот раствор альбумина следует затем подвергнуть и;з- рестным стадиям очистки, после чего его можно использовать в медицинской

практике. После промывки раствором с концентрацией 0,1 N и спиртом, колонка готова к новому цикЛу .использования ,

fO

i 20

5900314

На одной колонке бьто осуществле- , но более 50 циклов без потери эффекI ТИВНОСТИ.

4. Конечное разделение гамма-глобулинов и гемоглобина,

Устаиавликают концентрацию хлорида натрия в предыдущем фильтрате (135 л),. равную 8 г/л, рН 7,О и фильтрат ох- ла кдают до . Затем постепенно добавляют 45 л ох11а 1оденного до -20°С этанола при перемешивании и в конце добавления устанавливают окончательную температуру, равную , После 15 ночи полученную суспензию центрифугируют со скоростью 300 л/ч. Полученный осадок гамма-глобулинов весит в среднем 900 г (данные по нескольким партиям) и затем его следует подвергнуть другим операциям очистки, которые известны, для получения иммуноглобулинов, пригодных для использования в медицине.

Падосадочный слой полностью прозрачен. Он содержит практически избавленный от иммуноглобулинов гемоглобин. Его разводят 300 л воды при температуре 0°С для того, чтобы снизить концентрацию ниже 10%. Этот раствор

25

д концентрируют посредством ультрафильт- рации по описанной системе, он может

5

0

5

0

5

быть в конце подвергнут диафильтра- ции для регулирования ионной силы и состава раствора в соответствии с его будущим использованием. Количество полученного таким образом гемогло бина равно 3700 г, т.е. его выход близок к 25 г/кг плаценты.

Пример 2, Пример 2 повторяют аналогично примеру 1, за исключением того, что на стадии 1 осветления концентрация спирта составляет 15%,

П р и м е р 3. Осуществляют как и в примере 1, но за исключением того, что в конце стадии 2 концентрации и диафильтрации осветленной

крови величину рП доводят до 6,8, Б конце десятка циклов хроматографии констатируют, что колонка слегка подкрашена, что соответствует небольшому количеству протеина. Однако колонка еще не засорена, что указывает на значительный прогресс по сравнению с известным уровнем техники,

П р и м е р 4, Повторяют условия примера 1, но за исключением того, что в конце стадии концентрации и диафильтрации осветленной крови ве 1590031

личину рН доводят до 4,8. Осущест- вляют стадию хроматографического разделения, которая проходит беспрепятственно, но выход альбумина уменьшен.

Пример 5. Проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что хроматографию осуществляют на колонке с ДЕАЕ-:-сафарозой. Колонку уравновешивают и промывают тем же буфером. Фильтрат, содержащий гемоглобин и гамма-глобулины, полностью очищен от ал |бумина и его рекуперируют путем элюирования за счет раствора NaCl в концентрации 20 г/л.

П р и м е р 6. Осуществляют аналогично примеру 1, заменяя колонку для хроматографического разделения с ДЕАЕ трисакрилом. Полученные результаты те же, что и в примере 1. Свойства полученных альбумина и гемоглобина, такие же, как и в примере 1 .

Преимущество предлагаемого способа перед изве,стным закд1ючается в возможности промьш1ленной,обработки значительных количеств плацентарной гемо- лизированной крови путем разделения основных белков крови на хроматогра- фической колонке с почти непрерывным ее использованием без замены.

Предлагаемым способом можно обрабатывать хроматографией много тонн плацентарной крови в день, не заменяя

хроматографической колонки, в то вре- ,, тографическое разделение проводят

мя как для известного колонки необходимо менять в конце десятка прохождений, в то время как в предлагаемом они остаются без изменения. Во всех других способах при хроматографии гемолизированной крови колонки систематически засоряются.

на сферодексе-SS, или на ДЕАЕ-сефа розе, или ДЕАЕ-трисакриле при рН 4 6,8, а оставшийся гамма-глобулин удаляют из гемоглобиновой фр акции 40 путем спиртового-осаладения, а альб мин элюируют с колонки буфером, со держащим 20 г/л хлорида натрия.

6

Что касается способов, в которых не применяется хроматография, например селективного осаждения этанолом или другим растворителем, например сульфатом аммония, капр1шовой кислоты, риванолом, то они приводят к денатурации гемоглобина, который нельзя использовать, в то время как геМОглобин, полученный по предлагаемому способу неденатурирован.

Что касается альбумина, полученного по предлагаемому способу, то он содержит мономеров 100%, содержание агрегатов практически не определимо . Альбумин стабилен при нагревании его при температуре в течение 50 ч.

Формула изобретения

Способ получения альбумина и гемоглобина из плацентарной крови путем обработки гемолизированной плацентарной крови этанолом, фильтрации и хроматографического разделения на анионообменнике, отличающийся тем, что, с целью повьте- ния производительности процесса,

обработку этанолом проводят в концентрации 8-15% после фильтрации, фильтрат подкисляют до рН 5,1 и осветленную кровь подвергают ультрафильтрации и диафильтрации, а хромана сферодексе-SS, или на ДЕАЕ-сефа- розе, или ДЕАЕ-трисакриле при рН 4,8- 6,8, а оставшийся гамма-глобулин удаляют из гемоглобиновой фр акции 40 путем спиртового-осаладения, а альбумин элюируют с колонки буфером, содержащим 20 г/л хлорида натрия.

Изобретение относится к медицине и касается способа получения получения основных протеинов плацентарной гемолизированной крови. Цель изобретения - повышение производительности процесса. Способ осуществляют следующим образом. 150 кг человеческой плаценты дробят в замороженном виде, диспергируют в 150 л воды и 22 л этанола при T=°С до конечной концентрации 8%, затем эту суспензию перемешивают , фильтруют, к полученной жидкости добавляют соляную кислоту нормальной концентрации для доведения РНдо 5,1 при перемешивании T=0°С. Осветвленную кровь подвергают ультрафильтрации и после концентрации до 60 Л диафильтруют.